co-IP免疫共沉淀
▼ 服務介紹
免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎的用于研究蛋白質相互作用的經典方法。是確定兩種蛋白質在完整細胞內生理性相互作用的有效方法。
【實驗介紹】
Co-IP主要用于檢測蛋白質與蛋白質之間相互作用，是IP實驗的一種擴展， 基于IP反應的潛力，在樣品溶液中捕獲和純化主要目標（抗原等）及通過天然相互作用靶標結合的其他的大分子。此外，還可以利用Co-IP來確定在不同條件下的蛋白質相互作用。
CO-IP的應用場景主要是：
1、用于研究蛋白質復合體成分（通過IP級抗體直接捕獲目的蛋白族群，或通過構建帶標簽的目的蛋白融合表達載體并通過標簽蛋白的IP抗體進行免疫捕獲。常與western blot和蛋白質譜聯用進行IP產物分析）。
2、用于檢測生理狀態下存在的蛋白質互作關系。
3、 用于檢測蛋白質的修飾狀態，如泛素化。
【技術原理】
免疫共沉淀是利用抗原和抗體的特異性結合以及細菌的Protein G或A能特異性地結合到免疫球蛋白的Fc片段的方法。其基本原理是在細胞裂解液中加入感興趣蛋白的抗體，孵育后再加入與抗體特異結合的結合于磁珠的Protein G或A，若細胞中存在與興趣蛋白相結合的目的蛋白，就可以形成蛋白復合物：“目的蛋白—興趣蛋白—抗興趣蛋白抗體—Protein G或A”；最后通過免疫印跡實驗來檢測目的蛋白。
【實驗流程】
【技術總結】
1、實驗樣品制備方法準備：很重要！根據研究目的，檢測樣品可能是組織樣品，也可能是細胞樣品，不同樣品制備流程不太相同，目的蛋白表達量也有較大差別，必須選擇合適的樣品和樣品制備方法。
2、根據研究目的選擇適合的蛋白特異性抗體：非常重要！用于Co-IP實驗的抗體是針對目的蛋白的特異性抗體，最理想的是選擇一種能識別興趣蛋白質某個表位的抗體，且這個表位不會被任何其他蛋白質相互作用所掩蓋，比普通WB抗體要求高出很多；同時，抗體特異性和靈敏性盡可能高，才有可能有干凈的背景和較好的IP效果，所以必須選擇最適合的抗體用于Co-IP實驗。
【注意事項】
1、細胞裂解采用溫和的裂解條件，不能破壞細胞內存在的所有蛋白質－蛋白質相互作用，多采用非離子變性劑（NP-40 或 Triton- X-100)。每種細胞的裂解條件是不一樣的，通過經驗確定；
2、不能用高濃度的變性劑（0.2％SDS)，細胞裂解液中要加各種酶抑制劑；
3、使用對照抗體：單克隆抗體：正常小鼠的 IgG 或另一類單抗;兔多克隆抗體：正常兔 IgG；
4、確保共沉淀的蛋白是由所加入的抗體沉淀得到的，而并非外源非特異蛋白，單克隆抗體的使用有助于避免污染的發生；
5、要確保抗體的特異性，即在不表達抗原的細胞溶解物中添加抗體后不會引起共沉淀；
6、確定蛋白間的相互作用是發生在細胞中，而不是由于細胞的溶解才發生的，這需要進行蛋白質的定位來確定。
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