酵母雙雜實驗
▼ 服務介紹
【實驗原理】
轉錄因子通常含有兩個獨立的結構域:DNA結合域(BD)和轉錄激活域(AD)，只有當這兩種結構域共同作用時才能使轉錄正常進行。利用此特性，可以分別使BD與AD同“誘餌”蛋白(X)和“獵物”蛋白(Y)形成融合蛋白，一般把用來進行篩選的目的蛋白稱為“誘館”蛋白，而篩到的陽性克隆稱為“獵物”蛋白。單獨的BD與AD蛋白質游離于細胞中不同的位置而分開，不能激活報告基因的轉錄。如果兩種蛋白X和Y可以發生相互作用，就能使BD與AD在空間上充分接近，從而激活報告基因的轉錄。
【實驗步驟】
一、酵母感受態細胞制備
(1) 將-80℃保存的酵母菌株在YPDA固體培養基平板上劃線，30℃培養條件下倒置培養4-7d。
(2) 挑取單菌落至含3mLYPDA液體培養液中。
(3) 30℃培養，200rpm 震蕩培養8h。
(4) 當菌液OD值約為0.3時，轉移10uL菌液到含50mIYPDA培養液中。
(5) 30℃培養，200rpm震蕩培養16-20h至OD值為015-0.3。
(6) 700g轉速5min室溫離心收集細胞。
(7) 將底部沉淀使用已預熱至30℃的100mLYPDA中重懸酵母細胞。
(8) 30℃，200rpm，搖3-5h至OD值=0.6時。
(9) 5min室溫離心收集細胞。
(10) 將底部沉淀在30mL無菌超純水中重懸酵母細胞.
(11) 700g轉速5min室溫離心收集細胞。
(12) 將底部沉淀加入3mL的1.1XTE/LiAc重懸細胞。
(13) 將懸重懸細胞分成2管，6000g轉速室溫離心30s。
(15) 將底部沉淀加入500uL的1XTE/LiAc重懸酵母細胞，分裝為100uL每管。
二、轉化
（1）在干凈的1.5 mL的離心管中并振蕩混勻。
（2）每個離心管中加入100 μL的酵母感受態細胞，500 μL的PEG/LiAc溶液，加入兩種質粒，并且將管中的混合物進行旋渦振蕩，將其混勻。
（3）在30℃，220 rpm/min的搖床振蕩培養30 min。
（4）往每個離心管中加70 μL的DMSO，并溫和的上下顛倒混勻。將離心管在42℃水浴中熱激40 min（每隔10 min搖勻1次）。
（5）取出離心管，在冰上靜置2 min。
（6）吸取100 μL并涂布在相應的二缺固體培養基上，培養3-4天，待菌長好后，挑單菌落于10ulYPDA液體培養基中，30℃培養過夜。
互作驗證：
取過夜培養的菌液涂布于四缺平板上，將培養皿置于30℃恒溫培養箱中培養，觀察是否生長與顏色變化。
【常見問題與注意事項】：
（1）檢測感受態細胞效率，標準操作規范。
（2）注意質粒使用量，檢查儀器狀態。
（3）配制新鮮培養基，并做對照轉化，添加抑制劑，同時增設嚴格的對照組防止自激活。
（4）應挑選大的、新鮮的菌株克隆進行培養。
【交付標準】
1. 實驗報告
2. 真實實驗結果
3. 原始圖片
4. 實驗原始數據
5. 剩余物料在周期內可返還（超過周期，不予返還）
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