蛋白組
▼ 服務介紹
【實驗原理】
蛋白質組學是對蛋白質組的研究，研究不同的蛋白質之間如何相互作用以及它們在生物體內發揮的作用。雖然蛋白質的表達可以通過研究mRNA的表達來推斷，mRNA是基因和蛋白質之間的中間人，但mRNA的表達水平并不總是與蛋白質的表達水平有很好的相關性[1,3]。此外，對mRNA的研究并不考慮蛋白質的翻譯后修飾、裂解、復合物的形成和定位，或可以產生的許多變體mRNA轉錄本；所有這些都是蛋白質功能的關鍵。
【實驗步驟】
1. 樣品準備和處理，提取蛋白質。
2. 蛋白質酶解，將蛋白質切割為肽段。
3. 質譜檢測，得到質譜數據。
4. 數據庫檢索，將質譜數據轉化為蛋白質的鑒定和定量信息。
【常見問題與注意事項】
1、蛋白樣品不能反復凍融；
2、蛋白樣品應加蛋白酶抑制劑，以增加蛋白的穩定性（建議最好能多加幾中種蛋白酶抑制劑）；
3、細胞水平要做Western Blot，一般地5×106個細胞提取的蛋白夠就足Western Blot；
4、如果目標蛋白是膜蛋白和胞漿蛋白，所用的去垢劑就要溫和得多，建議提取后最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性；
5、若轉膜不完全，可以加大上樣量，還有轉移時你可以用降低電流延長時間，轉膜液中甲醇的比例多加5－10％；
6、如果上樣量超載，可以濃縮樣品，也可以根據你的目標分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超載30％是不會有問題的。如果已經超了不少了，而且小分子量的也要，可以考慮加大膠的厚度，可以試試1.5mm的 comb；
7、蛋白變性后，－80℃，一兩年沒有問題。最關鍵兩條：不要被蛋白酶水解掉；不要被細菌消化掉(也是被酶水解了)；
8、脫脂奶粉中含生物素，如果實驗中有涉及到“生物素”請將封閉液改為BSA封閉；
9、做200kd以上蛋白的Western Blot時要注意，分離膠最好選擇>7%的；剝膠時要小心；轉移時間需要相應延長；要做分子量參照（否則出現雜帶不知道如何分析）；
10、蛋白的上樣量要根據實驗的要求來定，如果要求是定量和半定量的Western Blot則上樣量要均等，如果只是要定性，則沒有太大的關系，盡量多上就行了，但是不要超過0.3μg/mm2；
11、一抗，二抗的比例是比較重要，調整好一抗，二抗的比例，可以去掉部分非特異的本底；12、免疫組化和Western Blot可以用同一種抗體嗎？
解答：免疫組化時抗體識別的是未經變性處理的抗原決定簇（又稱表位），有些表位是線性的，而有的屬于構象型；線性表位不受蛋白變性的影響，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；構象型表位由于受蛋白空間結構限制，煮后變性會消失。如果你所用的抗體識別的是蛋白上連續的幾個氨基酸，也就是線性表位，那么這種抗體可同時用于免疫組化和Western，而如果抗體識別構象形表位，則只能用于免疫組化。一般抗體說明書上都有注明此種抗體識別的氨基酸區間。（限于單抗）；
13、抗體工作溶液一般不主張儲存反復使用，但是如抗體比較珍貴，可反復使用2－3次。稀釋后應在2－3天內使用，4度保存，避免反復凍融；
14、NC膜 PVDF膜 尼龍膜的差異。
尼龍膜是較理想的核酸固相支持物，有多種類型；硝酸纖維素膜是目前應用最廣的一種固相支持物，價格最便宜；PVDF膜介于二者之間。
就結合能力而言：尼龍膜結合DNA和RNA能力可達480－600μg/cm2，可結合短至10bp的核酸片段；硝酸纖維素膜結合DNA和RNA能力可達80－100μg/cm2，對于200bp的核酸片段結合能力不強；PVDF膜結合DNA和RNA能力可達125－300μg/cm2。
就溫度適應性而言：尼龍膜經烘烤或紫外線照射后，核酸中的部分嘧啶堿基可與膜上的正電荷結合；硝酸纖維素膜依靠疏水性相互作用結合DNA，結合不牢固；PVDF膜結合牢固，耐高溫，特別適合于蛋白印跡。
就韌性而言：尼龍膜較強；硝酸纖維素膜較脆，易破碎；PVDF膜較強。
就重復性而言：尼龍膜可反復用于分子雜交，雜交后，探針分子可經堿變性被洗脫下來；硝酸纖維素膜不能重復使用；PVDF膜可以重復使用。
15、在做Western Blot時，PVDF膜用甲醇浸泡的目的。
PVDF膜用甲醇泡的目的是為了活化PVDF膜上面的正電基團，使它更容易跟帶負電的蛋白質結合，做小分子的蛋白轉移時多加甲醇也是這個目的。
【交付標準】
1. 實驗報告
2. 真實實驗結果
3. 原始圖片
4. 實驗原始數據
5. 剩余物料在周期內可返還（超過周期，不予返還）
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