免疫組學
▼ 服務介紹
【實驗原理】
應用免疫學及組織化學原理，對組織切片或細胞標本中的某些化學成分進行原位的定性、定位或定量研究，這種技術稱為免疫組織化學技術或免疫細胞化學技術。眾所周知，抗體與抗原之間的結合具有高度的特異性。免疫組化正是利用這一特性，即先將組織或細胞中的某些化學物質提取出來，以其作為抗原或半抗原去免疫小鼠等實驗動物，制備特異性抗體，再用這種抗體（第一抗體）作為抗原去免疫動物制備第二抗體，并用某種酶（常用辣根過氧化物酶）或生物素等處理后再與前述抗原成分結合，將抗原放大，由于抗體與抗原結合后形成的免疫復合物是無色的，因此，還必須借助于組織化學方法將抗原抗體反應部位顯示出來（常用顯色劑DAB顯示為棕黃色顆粒）。通過抗原抗體反應及呈色反應，顯示細胞或組織中的化學成分，在顯微鏡下可清晰看見細胞內發生的抗原抗體反應產物，從而能夠在細胞或組織原位確定某些化學成分的分布、含量。組織或細胞中凡是能作抗原或半抗原的物質，如蛋白質、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受體、酶、激素、核酸及病原體等都可用相應的特異性抗體進行檢測。
【實驗步驟】
一.固定、脫水、包埋
00001. 取組織放入4%多聚甲醛里面固定3-4小時,時間根據標本大小適當調整。
00002. 取適當大小組織放入包埋盒中,進行脫水。每個染缸液體體積約200ml,每次脫水可以裝20個包埋盒。依次進入:
75%酒精1.5小時、95%酒精1.5小時、95%酒精1小時、無水乙醇1.5小時、無水乙醇1小時、二甲苯一號0.5小時、二甲苯二號0.5小時。
打開包埋機,分別開啟冷臺,冷點,石蠟槽,組織槽進行工作。然后用鐵飯盒承裝石蠟塊并放入包埋機組織槽中加熱溶解。將脫水后的組織連同包埋盒依次放入機器組織槽中,然后再放入石蠟飯盒一號進行第二遍浸蠟,然后石蠟飯盒二號,進行三次浸蠟。
00003. 選大小符合的模具,先調整機器滴蠟的速度,不宜過快防止有氣泡。然后在模具中滴入液體石蠟,然后從飯盒二號中拿出浸后的包埋盒,打開用鑷子取出組織放入模具中。然后用包埋盒的另一半蓋住模具,再滴入少許石蠟后放到冷臺上冷卻。按上述步驟繼續包埋下一個蠟塊。
二.切片、制片
00001. 打開切片機,固定蠟塊(可提前4度冰箱預冷一下),調整刀片和蠟塊的距離。然后調整切片厚度,先粗切,看到完整的蠟片并且有組織后切換厚度,調整到自己想要切的厚度。用力均勻,右手搖動切片,左手用毛筆接片。如片子打卷,可以用毛筆按著蠟片的邊緣再緩慢切,這樣可以得到相對平整的片子。
00002. 用毛筆和鑷子將片子或者帶狀片子托起,放入水槽中展片,水溫在40度左右。然后用防脫片載玻片輕輕撈起,載玻片的邊緣盡量不要觸碰水槽底部,防止底部氣泡上浮殘留在片子上。然后標注切片編號放到烤片機上烤片30分鐘。
三.組織化學染色
00001. 室溫脫蠟、水化:二甲苯一號10分鐘、二甲苯二號8分鐘、二甲苯三號8分鐘、無水乙醇5分鐘、90%乙醇3分鐘、80%乙醇3分鐘、70%乙醇3分鐘。蒸餾水3分鐘*3次,PBS3分鐘*3次。
00002. 熱抗原修復,換新的切片架,放入水化后的切片。配置抗原修復液(一包檸檬酸鈉粉末配置2升PBS溶液),用鐵飯盒或者鍋加熱煮沸。溫度控制在96-98度。然后將切片放入熱鍋中15分鐘,最后自然冷卻室溫。PBS五分鐘*2次,蒸餾水3分鐘*2次。
00003. 免疫組化筆畫圈:取出組織,甩干水分,可用吸水紙吸干水珠。用組化筆畫圈圍住組織,圓圈完整。
00004. 滅活內源酶活性:將切片放入濕盒中,盒中加入少量蒸餾水,滴加3%過氧化氫(二抗試劑盒中A一滴或者50微升,劑量詳見二抗說明書),室溫孵育10分鐘。PBS三分鐘*3次,蒸餾水水洗三分鐘。
00005. 封閉非特異性位點:甩干水分,吸干水珠,加山羊血清封閉液(二抗試劑盒B一滴或者50微升),放入濕盒內,室溫10分鐘。
00006. 甩掉封閉液,滴加一抗蓋住組織,然后放入濕盒內4攝氏度過夜。(一抗濃度見抗體說明書,提前稀釋后分裝,并在負二十度冰箱保存。每張片子一抗劑量不定,看組織面積大小,xxxxx癌組織一張20微升左右。
00007. 第二天,4度冰箱取出濕盒,室溫復溫30分鐘,PBS三分鐘*三次,蒸餾水洗滌三分鐘。
00008. 甩干水分,吸干水珠,滴加二抗(二抗試劑盒C)一滴或者50微升,室溫孵育10分鐘。PBS三分鐘*三次,蒸餾水水洗三分鐘。
00009. 每張片子滴加一滴或者50微升鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液(二抗試劑盒D),室溫孵育10分鐘,PBS三分鐘*三次,蒸餾水水洗三分鐘。
00010. 每張片子滴加兩滴或者100微升DAB溶液,顯微鏡下觀察3-10分鐘。染色合適即可終止染色,自來水沖洗。
00011. 蘇木素復染,1-2分鐘,細胞核變藍色即可終止,自來水或者PBS沖洗反藍(可用0.5%氨水反藍)。
00012. 1%鹽酸酒精分化3秒,自來水沖洗三分鐘。
00013. 脫水:70%酒精1分鐘、80%酒精1分鐘、95%酒精2分鐘、無水乙醇4分鐘、二甲苯一號3分鐘、二甲苯二號3分鐘。
00014. 涼干片子后滴加適量中性樹膠封片,蓋上蓋玻片,小心氣泡。晾干半天即可。
顯微鏡下拍照。
【常見問題與注意事項】
1、標本固定
固定的目的是為了使蛋白質凝固，減少或終止內源性/外源性細胞內分解酶的反應，防止組織細胞自溶，保存組織或細胞內的抗原性。現在常用的固定劑有中性甲醛液，4%多聚甲醛-磷酸鹽緩沖液。有些固定劑對特殊組織有更好的效果，如苦味PLP固定液對于含糖組織保存更好，Helly固定液對于胰島和垂體效果較好等。
2、脫水、石蠟包埋和制片
脫水用梯度乙醇（由低到高）充分脫水，對于一些易脆的組織應減少高濃度酒精里的停留時間，透明的時間也應該控制縮短。對組織浸蠟時，一般選用56℃-58℃熔點石蠟，浸蠟溫度最好不超過60℃，防止抗原的損失。包埋時應果斷迅速，切片時注意檢查刀片是否出現缺口，防止；蠟帶出現裂痕。
3、脫蠟和水化
使組織恢復到固定后的正常狀態暴露抗原，方便與一抗結合。若脫蠟與水化不完全易出現局灶性反應和浸洗不完全，產生非特異性背景著色。
4、抗原修復
由于組織在甲醛或多聚甲醛在固定中，發生蛋白之間交聯及醛基的封閉作用，從而掩蓋抗原決定簇。通過抗原修復，使得細胞內抗原決定簇重新暴露，提高抗原檢測率，常用方法通常使用高壓加熱修復，使用高壓加熱修復對修復溫度和時間的把握十分重要，溫度越高修復時間越短，溫度與修復時間呈負相關。修復結束后注意室溫冷卻，讓蛋白自然復性。另外，大家盡量使用過量的抗原修復液，防止高溫液體揮發干涸，對切片造成不可逆影響。
5、標本固定
傳統的免疫組化法容易受到內源性過氧化物酶和生物素的干擾，必須對其進行滅活和封閉。滅活內源性過氧化酶一般用3%過氧化氫滅活10min左右，用甲醇配制過氧化氫更適合于保護抗原和固定組織。
6、血清封閉
血清封閉的目的是為了一抗與組織的非特異性結合，造成假陽性，一般會采用BSA、羊血清等封閉這些位點，封閉血清一般是和二抗同一來源的，室溫封閉10-30min。
7、一抗和二抗濃度和孵育時間
不同的一抗濃度，孵育時間和溫度等對染色結果往往有較大的影響。在4℃下，反應緩慢，背景較淺；而37℃反應較快，時間較短；室溫介于兩者之間，二抗一般室溫孵育30min。
8、DAB顯色
檢測背景的深淺和特異性染色的深淺基本上都以DAB孵育條件決定。DAB的顯色時間并不是固定的，主要方法是使用顯微鏡控制顯色時間，到出現特異性染色較強且出現背景著色較淺時就可以沖洗。如果DAB顯色時間過長（超過十分鐘）才出現陽性染色，可能是一抗體濃度過低或者封閉時間過長，也可以加入金屬離子來增強顯色（如硫酸銅、氯化鈷、硫酸鎳銨等）；如果DAB顯色時間過短顏色就很深，這可能是一抗過高，需要下調抗體濃度，如果短時間內過深
9、復染
免疫組化染色后為了襯托出組織形態結構有必要進行復染，常用試劑為Mayer’s蘇木染色，一般為2 min左右，DAB在核蛋白著色的時間可以適當縮短，最后用氨水或PH 8.0的TBS返藍。
10、封片
在封片階段我們通常是用中性樹膠來進行，封片過程中注意斜靠蓋玻片防止氣泡的產生從而對結果進行營影響，建議最好在通風櫥操作，這樣有利于氣泡排除干凈，不影響后續的鏡檢。
【交付標準】
1. 實驗報告
2. 真實實驗結果
3. 原始圖片
4. 實驗原始數據
5. 剩余物料在周期內可返還（超過周期，不予返還）
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