wb實驗
▼ 服務介紹
【實驗原理】
WB實驗是通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）將混合蛋白質樣品分離后，利用特殊虹吸或電場裝置印跡至固相介質（例如PVDF膜）上，再以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與相對應的第一抗體特異性結合，之后再與酶或同位素標記的第二抗體相結合，最終通過底物顯色或放射自顯影來檢測特異性目的基因表達的蛋白成分。
【實驗步驟】
一、蛋白樣本提取制備
1 細胞或組織裂解
2 蛋白酶和磷酸酶抑制劑
3 蛋白定量
4 電泳上樣樣品的準備
二、 電泳
1 PAGE 膠的制備
2 蛋白分子量 Marker
3 陽性對照
4 內參對照
5 上樣與電泳
三、 轉膜與顯色（ Western Blot）
1 膠中蛋白的檢測
2 蛋白轉膜
3 膜上蛋白的檢測：麗春紅
4 膜的封閉
5 一抗的孵育
6 二抗的孵育
7 顯色
【常見問題與注意事項】
一、蛋白樣本提取制備蛋白樣品制備是 Western Blotting 的第一步，是決定 WB 成敗的關鍵步驟之一。
蛋白提取總體原則與注意事項包括：
1) 盡可能提取完全或降低樣本復雜度使得集中于提取目的蛋白（通過采用不同提取方法或選擇不同的試劑盒產品）。
2) 保證蛋白處于可以溶解狀態（通過裂解液的pH 、鹽濃度、 表面活性劑、還原劑等的選擇實現）。
3) 提取過程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修飾等（全程保證在冰盒中低溫操作，加入合適的蛋白酶和磷酸酶抑制劑）。
4) 盡量去除核酸，多糖，脂類等干擾分子（通過加入核酸酶或采取不同提取策略）。
5) 樣品分裝，長期于-80℃中保存，避免反復凍融。
6)條帶不清晰：可能是由于抗體質量不佳、孵育條件不當或顯色反應不足等原因造成。可以嘗試更換抗體、調整孵育條件或延長顯色時間來解決。
7) 背景過深：可能是由于抗體濃度過高、孵育時間過長或顯色過度等原因導致。可以適當降低抗體濃度、縮短孵育時間或減少顯色反應時間以改善背景。
8) 非特異性結合：可能是由于樣品中存在雜質或抗體特異性不足引起。可以通過優化樣品處理、選擇特異性更強的抗體或增加洗滌次數來減少非特異性結合。
總之，在進行WB實驗時，需要注意實驗前的準備、樣品處理與電泳、轉膜與抗體孵育、顯色與結果分析以及實驗后的處理等方面。通過遵循標準操作程序、注意細節和常見問題解決方案，可以確保實驗結果的準確性和可靠性。同時，保持實驗記錄的完整性和可追溯性對于后續分析和實驗總結也至關重要。
【交付標準】
1. 實驗報告
2. 真實實驗結果
3. 原始圖片
4. 實驗原始數據
5. 剩余物料在周期內可返還（超過周期，不予返還）
康旭禾生物提供包括動物實驗、細胞實驗、分子實驗、病理實驗、流式檢測實驗及論文翻譯、潤色、投稿輔助等相關的各項服務。
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