穩定株篩選
▼ 服務介紹
【實驗原理】
通過將外源DNA/shRNA克隆到帶有某種抗性基因的載體上，重組載體轉染至宿主細胞并整合到其染色體中，并隨細胞分裂穩定傳遞，最后用載體中所含抗性基因進行篩選。
【實驗步驟】
第一步：篩選濃度測定，以10~14 天細胞全部死亡的抗生素濃度為篩選濃度；
第二步：進行細胞接種，轉染實驗前天接種細胞，各種細胞的平板密度依據各種細胞的生長率和細胞形狀而定。進行轉染當天細胞密度應達到60%~80% 覆蓋；
第三步：進行細胞轉染
第四步：利用質粒上含有的抗性選擇進行篩選，并鑒定篩選結果。
方法二：應用逆轉錄病毒，慢病毒轉染，篩選穩定細胞株。慢病毒可以攜帶外源基因隨機整合進基因組。轉染得到穩定細胞株的效率高，是建立穩定株的最優方式。
第一步：將人源化的抗體基因轉接到慢病毒載體上，
第二步：使用包裝細胞，一般為293細胞，包裝出病毒，不同類型病毒包裝時間一般在3-5天。
第三步：用病毒轉染目的細胞。包裝好的病毒要先測滴度，根據滴度決定轉染目的細胞的病毒量。
第四步：后期篩選。轉染目的細胞1-2天后加抗生素篩選得到穩定細胞株。
【常見問題與注意事項】
1、篩選前的準備
篩選前我們需要確定藥物篩選的相關濃度。對于不同的細胞來說，對藥物的敏感度是各不相同的，需要在細胞能夠承受的濃度范圍內，否則，很容易造成細胞表達低甚至死亡的情況,
2、篩選過程中的注意事項
司一般在72小時;篩選時間:一般在轉染后48小時后進行，而對于慢病毒來說加藥時
包的變化情況;空白對照:在加藥篩選時，需要提前設置好空白對照，全程對比細
換液操作:當細胞死亡達到一定的程度后，需要及時換液，以避避免,害物質造成細胞的死亡,3、克隆篩選過程中的注意事項
在進行單克隆篩選的時候，如果有熒光標記，則盡量選擇那些帶有光較強的細胞;如果質粒不帶熒光標記，則只能進行盲挑。當然了，無論是否帶有熒光標記，都需要對其進行驗證，而且盡量多挑幾個來進行克隆，以保證成功率。
【交付標準】
1. 實驗報告
2. 真實實驗結果
3. 原始圖片
4. 實驗原始數據
5. 剩余物料在周期內可返還（超過周期，不予返還）
康旭禾生物提供包括動物實驗、細胞實驗、分子實驗、病理實驗、流式檢測實驗及論文翻譯、潤色、投稿輔助等相關的各項服務。
聯系方式：19379182007
公司地址：江西省南昌市南昌縣小藍VR產業基地D座2樓
客戶支持
在線咨詢
