侵襲
▼ 服務介紹
【實驗原理】
將細胞小室放入培養板中，小室內稱上室，培養板內稱下室，上室內盛裝上層培養液，下室內盛裝下層培養液，上下層培養液以聚碳酸酯膜相隔。我們將細胞種在上室內，由于聚碳酸酯膜有通透性，下層培養液中的成分可以影響到上室內的細胞，從而可以研究下層培養液中的成分對細胞生長、運動等的影響。
【實驗步驟】
1. 實驗材料準備：
1. 細胞培養相關：處于對數生長期、狀態良好且無污染的細胞系；細胞培養基，如含血清的完全培養基用于常規細胞培養、無血清培養基用于實驗；胰酶等細胞消化液，用于消化細胞使其從培養容器表面脫離。
2. 試劑：基質膠（如 Matrigel），用于模擬細胞外基質；4% 多聚甲醛固定液，用于固定細胞；結晶紫染液等用于染色；無菌 PBS 緩沖液，用于清洗細胞。
3. 耗材與儀器：Transwell 小室（一種具有通透性膜的小裝置，膜上有微孔可供細胞穿過）；細胞培養板；顯微鏡；槍頭、離心管等常規實驗耗材；鑷子、濕棉簽等操作工具。
2. Transwell 小室準備：
1. 基底膜水化（無基質膠的小室可省略此步驟）12：
1. 將 Transwell 小室放入孔板中，每個小室孔中加入適量的無血清培養液，一般為 50 μl。
2. 將孔板放入 37℃的細胞培養箱中溫育 30 分鐘，使基底膜充分水化，為后續細胞的遷移和侵襲提供適宜的環境。
2. 鋪基質膠（模擬細胞外基質環境）：
1. 基質膠需提前在 4℃冰箱中過夜融化，并始終保持在冰上操作，防止其在室溫下迅速凝固。
2. 用預冷的槍頭吸取適量的基質膠，垂直地加入到 Transwell 小室的上室底部中央，加膠量要適中，避免過多或過少。例如，對于常見的 24 孔 Transwell 小室，加入 60 - 80 μl 的基質膠12。
3. 將加好基質膠的 Transwell 小室放入 37℃的細胞培養箱中，孵育一段時間，讓基質膠充分聚合凝固，通常需要 30 - 60 分鐘，具體時間可根據基質膠的說明書和實際實驗情況確定。
3. 細胞懸液制備2：
1. 提前對細胞進行饑餓處理，將細胞培養在無血清的培養基中 12 - 24 小時，去除細胞周圍的血清影響，使細胞處于相對同步的狀態，增強實驗的重復性。
2. 用胰酶消化細胞，當在顯微鏡下觀察到細胞變圓、從培養容器表面脫離時，加入含血清的培養基終止消化。
3. 將細胞懸液轉移到離心管中，進行離心，一般以 800 - 1000 rpm 的轉速離心 3 - 5 分鐘，去除上清液（即舊的培養液）。
4. 用無菌 PBS 緩沖液洗滌細胞 1 - 2 次，再次離心去除 PBS 緩沖液。
5. 用含有 BSA（牛血清白蛋白）的無血清培養基重新懸浮細胞，調整細胞密度至合適的濃度，一般為 1 - 10×10? 個 /ml，具體密度可根據細胞類型和實驗需求進行摸索2。
4. 細胞接種2：
1. 取適量的細胞懸液，加入到 Transwell 小室的上室中，注意要緩慢加入，避免產生氣泡。對于 24 孔 Transwell 小室，一般加入 100 - 200 μl 的細胞懸液。
2. 在孔板的下室中加入適量的含有血清（如 10% 胎牛血清）或特定趨化因子的培養基，作為吸引細胞遷移和侵襲的誘導劑。例如，對于 24 孔板的下室，通常加入 600 μl 的培養基。
5. 細胞培養：
1. 將接種好細胞的 Transwell 小室放入細胞培養箱中進行培養，培養時間根據細胞的遷移和侵襲能力而定，通常為 12 - 48 小時2。
2. 在培養過程中，定期觀察細胞的狀態和小室的情況，如是否有氣泡產生等2。
6. 結果統計2：
1. 直接計數法：
1. 細胞固定：小心取出 Transwell 小室，吸去上室內的培養基，用棉簽輕輕擦拭基質膠和上室內未穿過膜的細胞。然后，將小室放入含有 4% 多聚甲醛的孔板中進行固定，固定時間為 20 - 30 分鐘。
2. 細胞染色：吸去固定液后，將小室移至預先加入結晶紫染液的孔中，讓細胞染色 15 - 30 分鐘。之后，去除未與細胞結合的結晶紫，可輕輕用棉簽擦拭小室的上側。
3. 細胞計數：用清水沖洗小室，吸干上室內的液體。使用鑷子小心地將膜揭下，確保底面朝上并風干。將膜轉移到載玻片上，用中性樹膠進行封片。在高倍顯微鏡下觀察和拍照，隨機選擇多個視野（如 5 個或更多），計數呈紫色的陽性細胞，最后統計結果。
2. 間接計數法：如 MTT 法、熒光試劑檢測等。以 MTT 法為例，吸去上室內的培養基和未穿過膜的細胞，在孔板中加入含 MTT 的完全培養基，孵育后加入 DMSO 溶解甲臜，最后在酶標儀上測 OD 值，間接反映細胞的數量。
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【常見問題與注意事項】
1. 細胞聚集：
1. 原因：細胞懸液制備過程中操作不當，如吹打不均勻、離心速度或時間不合適等，導致細胞沒有充分分散，容易聚集在一起；或者細胞本身的特性使得它們之間存在較強的黏附性。在侵襲實驗中，細胞聚集會影響細胞穿過膜的能力，導致實驗結果不準確。
2. 解決方法：制備細胞懸液時，要確保吹打均勻，力度適中且避免產生氣泡。可以使用適當的細胞篩過濾細胞懸液，去除聚集的細胞團。另外，調整離心的速度和時間，確保細胞能夠充分沉淀且不被過度損傷。
2. 基質膠相關問題：
1. 膠液凝固異常：
1. 原因：基質膠對溫度非常敏感，在室溫下容易迅速凝固。如果在操作過程中，室溫過高或者操作時間過長，基質膠可能會在未使用前就過早凝固；相反，如果在鋪膠后溫度過低，膠液可能凝固不完全，影響實驗結果。
2. 解決方法：整個鋪膠過程應在冰上操作，提前將所需的槍頭、離心管等器具在 4℃預冷。使用前將基質膠在 4℃冰箱中過夜融化，確保其處于液態。在加入基質膠到小室時，要迅速且準確地操作，避免膠液在槍頭或小室中凝固。
2. 膠層不均勻或有氣泡：
1. 原因：在加入基質膠時，如果速度不均勻或者角度不合適，容易導致膠層不均勻；操作過程中帶入的空氣或者小室底部不平整，會產生氣泡。膠層不均勻會使細胞穿過膜的難度不一致，而氣泡會阻礙細胞的遷移，影響實驗的準確性。
2. 解決方法：向小室底部中央垂直加入基質膠，保持勻速和穩定的操作，使膠液能夠均勻地覆蓋在小室底部。加入膠液后，可以將小室輕輕晃動或放置在水平臺上觀察，如有氣泡，可使用槍頭小心地將其戳破。
3. 細胞穿過膜的數量異常：
1. 原因：細胞的狀態不佳，如細胞活力低、處于非對數生長期、受到污染等，都會影響細胞的侵襲能力，導致穿過膜的細胞數量減少；實驗中使用的血清濃度、趨化因子等誘導條件不合適，也可能無法有效地吸引細胞穿過膜；另外，小室的孔徑選擇不當，對于體積較大的細胞，如果小室孔徑過小，會限制細胞的通過，而孔徑過大則可能導致非侵襲性的細胞也能輕易穿過，影響實驗結果的準確性。
2. 解決方法：確保使用的細胞處于對數生長期且活力良好，在實驗前進行細胞活力檢測，細胞活力需大于 95%2。根據實驗需求和細胞類型，優化血清濃度、趨化因子等誘導條件。選擇合適孔徑的小室，一般常用的為 8.0 - μm 孔徑。
4. 染色和計數問題：
1. 染色不充分或過度染色：
1. 原因：染色液的濃度、染色時間等因素都會影響染色效果。如果染色液濃度過低或染色時間過短，細胞可能染色不充分，導致在顯微鏡下觀察時細胞不清晰，難以準確計數；而染色液濃度過高或染色時間過長，會使細胞過度染色，背景顏色深，也會影響細胞的觀察和計數2。
2. 解決方法：根據使用的染色液類型，按照說明書或經驗確定合適的染色液濃度和染色時間。在染色過程中，可以定期在顯微鏡下觀察染色效果，以便及時調整染色條件。
2. 計數不準確：
1. 原因：在計數時，如果視野選擇不隨機或者視野數量過少，會導致計數結果不具有代表性；細胞在膜上的分布不均勻，或者存在細胞重疊的情況，也會影響計數的準確性；此外，如果在擦去上室細胞時操作不當，可能會將下室的細胞也擦掉，導致計數結果偏低。
2. 解決方法：在計數時，應隨機選擇多個視野，包括上、下、中央、左、右等不同位置的視野，以提高計數的準確性和代表性。對于細胞分布不均勻的情況，可以在計數前輕輕晃動小室，使細胞分布相對均勻。擦去上室細胞時，要使用濕潤的棉簽輕輕擦拭，避免用力過大擦掉下室的細胞。
侵襲實驗注意事項：
1. 實驗材料的準備：
1. 細胞培養：確保細胞來源可靠，無污染。在實驗前，將細胞培養至對數生長期，以保證細胞具有良好的活力和侵襲能力2。
2. 試劑和耗材：基質膠需保存在 -20℃，使用前在 4℃過夜融化2。其他試劑如無血清培養基、固定液、染色液等，要確保其質量和有效期。Transwell 小室等耗材要選擇質量可靠、孔徑合適的產品。
2. 實驗操作過程：
1. 無菌操作：整個實驗過程應在無菌條件下進行，包括細胞的培養、試劑的配制和添加、小室的操作等，以避免細胞污染2。
2. 基底膜水化：在鋪膠之前，需要對小室的基底膜進行水化處理，一般加入無血清培養液在 37℃溫育一段時間，為細胞的遷移和侵襲提供適宜的環境。
3. 細胞接種：細胞懸液的濃度要準確調整，接種時要將細胞懸液均勻地加入到小室中，避免產生氣泡或細胞聚集。同時，要注意控制細胞的接種數量，過多或過少都會影響實驗結果。
4. 培養條件：根據細胞的特性和實驗需求，選擇合適的培養時間和培養條件，如溫度、二氧化碳濃度等。培養過程中要避免小室的晃動或移動，以免影響細胞的遷移和侵襲。
3. 數據記錄和分析：
1. 實驗記錄：詳細記錄實驗過程中的各項參數，如細胞類型、細胞數量、基質膠濃度、培養時間等，以便后續分析和重復實驗。
2. 數據分析：采用合適的數據分析方法，對細胞穿過膜的數量進行統計和分析。可以使用直接計數法或間接計數法，但要注意操作的準確性和重復性。同時，要對實驗結果進行合理的解釋和討論，結合生物學背景和實驗目的，判斷實驗結果的可靠性
【交付標準】
1. 實驗報告
2. 真實實驗結果
3. 原始圖片
4. 實驗原始數據
5. 剩余物料在周期內可返還（超過周期，不予返還）
康旭禾生物提供包括動物實驗、細胞實驗、分子實驗、病理實驗、流式檢測實驗及論文翻譯、潤色、投稿輔助等相關的各項服務。
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