什么是PCR，病毒是如何被檢測出來的？
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發(fā)表時間：2024-07-30
聚合酶鏈反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術。它能在一個試管內將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數小時內擴增至十萬乃至百萬倍,使肉眼能直接觀察和判斷；可從一根毛發(fā)、一滴血、甚至一個細胞中擴增出足量的DNA供分析研究和檢測鑒定。PCR技術是生物醫(yī)學領域中的一項革命性創(chuàng)舉和里程碑。PCR實驗室其實功能極其強大，定性分析和定量檢測是它最大的兩個應用方向，那除了新冠核酸檢測，我們“萬能”的PCR實驗室還能做些什么呢？接下來就給大家展示幾個具體應用方向的項目示例，也希望通過這些示例可以給各級醫(yī)療系統(tǒng)提供一些項目開展的思路和方向。
病原體測定
PCR技術的問世使病原體檢測能夠方便地進行，具有特異性強、靈敏度高、操作簡便、省時等特點，它不僅可用于基因分離克隆和核酸序列分析等基礎研究，還可用于疾病的診斷和任何有DNA和RNA的地方。由于PCR技術假陽性率太高，只要有微量病原體存在就可得到陽性結果，這并不能作為診斷依據，只有當一定數量的病原體存在時才有臨床意義。因此，對模板準確定量顯得特別重要，應用熒光技術PCR就能夠快速、準確地得到結果。對于解決免疫學檢測的“窗口期”問題，判斷疾病是否處于隱性或亞臨床狀態(tài)，以及抗體檢測不能判定是現癥感染還是既往感染時，均可利用PCR進行確定。用于體外定性檢測新型冠狀病毒感染的肺炎疑似病例、疑似聚集性病例患者、其他需要進行新型冠狀病毒感染診斷或鑒別。
遺傳病檢測
基因突變和拷貝數變異是遺傳病發(fā)生的主要遺傳學基礎，也是遺傳病檢測的主要靶標。遺傳病的復雜性伴隨著基因突變數目多、類型廣；基因拷貝數變異不僅表現為缺失和復制，而且缺失位置、大小以及復制倍數都呈現多樣性。遺傳變異的復雜性為遺傳病的臨床檢測提出了技術挑戰(zhàn)。實時PCR技術是我們最近發(fā)展起來新一代實時PCR技術，利用熒光標記或熔點分析，可以在單個反應管內檢測多個靶標。
腫瘤研究
腫瘤是危害人類健康的一種疾病，它的惡性程度與預后判斷主要依靠是否有轉移和病理切片分期。隨著分子生物學的迅猛發(fā)展，腫瘤研究領域的大量研究成果顯示，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、治療和預后與腫瘤細胞內部基因和腫瘤相關病毒有關。很多原癌基因和抑癌基因的表達情況的檢測都可揭示了癌變的可能性，而PCR方法學可以解決此類問題，此外，PCR方法用于體外定性檢測人外周血血漿中septin9基因甲基化，用于各種腫瘤的臨床輔助診斷。
病毒是如何被檢測出來的？
病毒性疾病的臨床診斷主要是利用建立在抗原和抗體特異性反應基礎上的免疫學方法，這些方法或者是以已知抗原來檢測抗體，或者是以已知抗體來檢測抗原，免疫學方法所進行的病毒診斷準確、靈敏、快速、簡便、成本低。PCR是一種在體外高效擴增特異性DNA的方法。其原理是用一對與雙鏈DNA互補的人工合成寡核苷酸作引物，使靶DNA在試管內特異地反復復制，直到能夠用標準的核酸雜交方法檢測出來。此復制過程可導致靶DNA上百萬倍擴增，擴增產物的由兩個引物與DNA模板結合部位之間的距離決定。其方法是靶DNA首先在90~95℃加熱變性，冷卻至37~50℃退火，使引物與靶DNA的特異序列互補配對，在67~70℃由大腸桿菌Taq聚合酶進行每一條鏈的復制。新合成的DNA鏈含引物的互補序列，可作為下一輪聚合反應的模板。如此變性、退火、聚合，在溫度91、50、67℃調節(jié)下反復進行，使靶DNA大量擴增，擴增的DNA拷貝數（Y）、放大效率（X）和循環(huán)次數（n）有以下關系：Y=（1+X）n。由于多聚酶鏈反應能夠直接高效擴增核酸，所以即使只要有極微量的病毒核酸存在，經擴增后都可以方便地檢出，對其進行克隆和序列測定，或以其它方法進行分析。通過選擇特異性的寡核苷酸引物，也可以確定病毒的類型。原則上，只要有一個病毒基因存在，就可以利用這一技術檢測出來，故大大提高了病毒檢測方法的靈敏性。第一例人免疫缺陷病毒2型（HIV-2）就是用這種方法發(fā)現的。(2023-8-17-22)
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