蛋白質含量測定方法對比
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發表時間：2024-10-15
前言:
蛋白質是生命的物質基礎，是生命活動的主要承擔者，也是科研工作中的重要研究對象。其中蛋白質的含量測定是生物化學和其他生命學科最常涉及的分析內容，是臨床上診斷疾病及檢查康復情況的重要指標，也是許多生物制品、藥物、食品質量檢測的重要指標，在生化實驗中，對樣品中的蛋白質進行準確可靠的定量分析，是一項非常重要的工作。
2020版中國藥典中收錄了6種蛋白質含量的測定方法，分別是凱氏定氮法、雙縮脲法、福林酚法（Lowry法）、雙縮脲法、2,2'-聯喹啉-4,4'-二羧酸法（BCA法）、考馬斯亮藍法（Bradford法）和紫外-可見分光光度法，另外常用的還有高效液相色譜法（HPLC法）和酶聯免疫吸附法（ELISA法）。這些方法基本上都是根據蛋白質的理化性質和生物學活性建立起來的，本文重點是對這幾種方法的原理和特點進行比較。 凱氏定氮法：
原理：蛋白質為含氮的有機化合物，當與硫酸和硫酸銅、硫酸鉀一同加熱消化時使蛋白質分解，分解的氨與硫酸結合生成硫酸銨；然后堿化蒸餾使氨游離，用硼酸液吸收后以硫酸滴定液滴定，根據酸的消耗量算出含氮量，再將含氮量乘以換算系數，即為蛋白質的含量。除另有規定外，氮轉換為蛋白質的換算系數為6.25（蛋白質中的含氮量通常占其總質量的16%左右，假設測定物質中的氮全來自蛋白質，則蛋白質含量=含氮量/16%=含氮量×6.25）。
優點：（1）該方法為絕對定量，在蛋白標準品賦值時使用，一般不作為常規的檢定方法；（2）不需要昂貴的儀器設備。
缺點：操作繁瑣，且靈敏度較低，結果受非蛋白氮的影響，目前已很少應用。
雙縮脲法：
原理：本法系依據蛋白質分子中含有的兩個以上肽鍵在堿性溶液中與Cu2+形成紫紅色絡合物，在540nm處有最大的光吸收，且在一定范圍內其顏色深淺與蛋白質濃度呈正比，以蛋白質對照品溶液作標準曲線，采用比色法測定供試品中蛋白質的含量。優點：本法快速、靈敏度低，測定范圍通常可達1～10mg。缺點：此反應并非蛋白質所特有，凡分子內有兩個或兩個以上肽鍵的化合物以及分子內有H2N—CH＝NH-CH2-NH2等結構化合物，雙縮脲反應也呈陽性，干擾測定的物質主要有硫酸銨、三羥甲基氨基甲烷緩沖液和某些氨基酸等。
Lowry法：
原理：本法系依據蛋白質分子中含有的肽鍵在堿性溶液中與Cu2+螯合形成蛋白質-銅復合物（第一步雙縮脲反應），此復合物使酚試劑的磷鉬酸還原，產生藍色化合物，同時在堿性條件下酚試劑易被蛋白質中酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸還原呈藍色反應，在一定范圍內其顏色深淺與蛋白質濃度呈正比，以蛋白質對照品溶液作標準曲線，采用比色法測定供試品中蛋白質的含量。
優點：（1）本法靈敏度較高，適合蛋白質的微量測定，測定范圍為40～200μg，定量范圍為5~100μg/ml；（2）該法所用儀器簡單，不同蛋白質間的變異少，是蛋白質量化的可靠方法，目前國內外多數細胞因子類制品的蛋白質含量采用該法測定。
缺點：（1）對本法產生干擾的物質較多，對雙縮脲反應產生干擾的離子，同樣容易干擾福林酚反應，且影響更大（如還原物質、酚類、枸櫞酸、硫酸銨、三羥甲基氨基甲烷緩沖液、甘氨酸、糖類、甘油等均有干擾作用）；（2）該法反應速度慢、耗時較長。BAC法：
原理：本法系依據蛋白質分子中含有的肽鍵在堿性溶液中與Cu2+螯合形成蛋白質-銅復合物（第一步雙縮脲反應），此復合物使酚試劑的磷鉬酸還原，產生藍色化合物，同時在堿性條件下酚試劑易被蛋白質中酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸還原呈藍色反應，在一定范圍內其顏色深淺與蛋白質濃度呈正比，以蛋白質對照品溶液作標準曲線，采用比色法測定供試品中蛋白質的含量。
優點：（1）本法靈敏度較高，適合蛋白質的微量測定，測定范圍為40～200μg，定量范圍為5~100μg/ml；（2）該法所用儀器簡單，不同蛋白質間的變異少，是蛋白質量化的可靠方法，目前國內外多數細胞因子類制品的蛋白質含量采用該法測定。
缺點：（1）對本法產生干擾的物質較多，對雙縮脲反應產生干擾的離子，同樣容易干擾福林酚反應，且影響更大（如還原物質、酚類、枸櫞酸、硫酸銨、三羥甲基氨基甲烷緩沖液、甘氨酸、糖類、甘油等均有干擾作用）；（2）該法反應速度慢、耗時較長。
Bradford法：
原理：本法屬于染料結合法，考馬斯亮藍G250是一種甲基取代的三苯基甲烷，每分子包含兩個磺酸基團，呈酸性，該磺酸基團能夠通過范德華力與蛋白質分子中的堿性氨基酸（精氨酸）和芳香族氨基酸結合形成穩定的染料-蛋白藍色復合物，在595nm波長處有最大吸收峰，并且在一定濃度范圍內，復合物顏色深淺與蛋白質含量呈正比，以蛋白質對照品溶液作標準曲線，采用比色法測定供試品中蛋白質的含量。
優點：（1）本法靈敏度高，據估計比Lowry法約高四倍，通常可測定1～200μg的蛋白質量；（2）本法測定簡便、快速、需要供試品量少，只需加一種試劑，反應10min。
缺點：（1）本法較Lowry法的干擾物質少，但是仍有一些物質干擾此法的測定，如去污劑、Triton X-100、十二烷基硫酸鈉（SDS）等，供試品緩沖液呈強堿性時也會影響顯色；（2）由于各種蛋白質中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白質測定時有較大的偏差。
紫外-可見分光光度法：
原理：蛋白質分子中的芳香族氨基酸，包括色氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸，含有可以吸收紫外光的共軛雙鍵，在280nm波長處有最大吸收峰，且在此波長內吸光度與其濃度成線性關系。通過分光光度計檢測目標蛋白280nm處的波長，即可根據Beer-Lambert定律（A=E*C*l；A代表吸光度，E代表消光系數，C代表蛋白質濃度，l代表光徑長度，其中消光系數可以根據蛋白質序列估測）換算出目標蛋白的濃度。
優點：（1）本法操作簡便快速，具有無與倫比的便捷性和高效性，可以通過Nanodrop等儀器在幾秒內直接讀出一個樣本的蛋白濃度；（2）本法的靈敏度較高，可以達到微克級別，適用于較純凈、成分相對單一的蛋白質檢測，一般供試品濃度為0.2～2mg/ml；（3）本法不用額外添加檢測試劑，對蛋白質無破壞性，不影響蛋白活性。
缺點：但本法準確度較差，干擾物質多，因為很多化合物在280nm處有吸光值，會對實驗結果造成干擾，尤其是核酸存在嚴重干擾，故要準確測量，必須要有待測蛋白質或其它蛋白的純品作標準品參考。
HPLC法：
原理：溶于流動相中的樣品各組分經過固定相時，由于與固定相發生作用（吸附、分配、排阻、親和）的大小、強弱不同，在固定相中滯留時間不同，從而先后從固定相中流出。
特點：具有定量準確、靈敏度高、重復性好、自動化程度高等特點，多用于成品的質量控制，且需要同種蛋白質做為標準品。
ELISA法：
原理：特異蛋白含量測定方法，將一定濃度的抗原或者抗體通過物理吸附的方法固定于微孔板內，加入待檢樣品，通過酶標物顯色的深淺間接反映被檢樣品的存在與否或者量的多少。
特點：該法特異性強、靈敏度高、可同時測定多個樣品，適用于生產過程中目標蛋白質含量的測定。
通過以上對比我們不難發現，對于蛋白質含量測定，每一種方法都有自身的優勢和缺陷，目前依舊沒有一個完美的解決方案，針對同一樣本采用不同的方法進行檢測，檢測結果也可能出現偏差。因此不同品種應針對自身蛋白質特性選擇適宜的測定方法并做相應的方法學驗證，同時應盡可能選用與待測定品種蛋白質結構相同或相近的蛋白質作標準品，這樣實驗數據才會更可靠。
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