細胞實驗 | 關于流式細胞術的那些事
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發表時間：2024-10-15
什么是流式細胞術？
流式細胞術（Flow Cytometry，FCM）能夠快速測定細胞懸液中單個細胞的生物學性質，并可以對特定的細胞進行分選收集。廣泛用于細胞生物學，免疫學，遺傳學，基礎醫學等領域。
高速客觀、結果穩定、具有統計學意義，能夠處理復雜樣本并同時獲取多種參數，是它的特點和優勢。
那么，流式細胞儀究竟可檢測哪些樣本？都能檢測什么指標？今天就具體來給大家講一講樣本的分類以及流式細胞術的應用有哪些。
①可檢測樣本類型
?外周血、骨髓、細胞穿刺液、洗脫液、實體組織、培養細胞、微生物。
②可檢測細胞結構
?如細胞大小、細胞粒度、DNA含量與細胞周期 （可以發現癌前病變，協助腫瘤早期診斷) 、RNA含量、蛋白質含量、染色體分析（可用于人類基團組研究、遺傳病和癌癥的診聽的研究）等。
③可檢測細胞功能
?如細胞表面/包漿/核的特異性抗原 (評估人體細院免疫功能，對血液病的診斷和治療檢測)、細胞活性、細胞內細胞因子、酶活性、激素結合位點 、細胞受體、細胞凋亡（研究多藥耐藥基因）等。
在了解了流式細胞術覆蓋的實驗類型后，就要開始進行實際操作了，有3個流式細胞實驗過程中常常會踩「坑」需要提前注意，包括：
● 小心熒光淬滅：如果抗體孵育時間過長，熒光是會逐漸淬滅的。那如果不得不推遲實驗可以把試管放在冰里面，延長淬滅的時間。
● 注意染色順序：做一系列的不同染色順序的樣本，通過對染色前和染色后的各種樣本進行比較分析，判斷染色順序對細胞造成的影響。
● 選好染色方案：在正式開始實驗之前，通過預實驗，設計出一個完美的染色方案。（考慮試劑種類，試劑質量，試劑用量，孵育時間，洗滌次數，染料濃度，染色時間及染色溫度等其他因素）。
了解完流式細胞術的檢測樣本，那么，流式細胞術具體應用在哪些領域呢？我們也來了解下。
01
流式細胞術科研應用
①細胞凋亡檢測
在正常細胞中，細胞膜上的磷脂酰絲氨酸（PS）位于胞漿側。細胞凋亡中期，PS 外翻。Annexin V 是一種 Ca2+ 依賴的對 PS 具有高度親和力的磷脂結合蛋白，因此可以用熒光標記的 Annexin V 檢測 PS 的外翻。凋亡末期，細胞膜結構受損，原本不透膜的核酸染料（如 PI、7-AAD 等）也能進入細胞，從而產生信號。分別檢測 Annexin V 和不透膜核酸染料的信號，可對凋亡中期和末期細胞的比例進行定量。
②細胞周期檢測
細胞核 DNA 含量隨著細胞增殖周期時相的不同而發生變化，用 DNA 染料進行染色，DNA 含量多，熒光信號強，DNA 含量少，熒光強度低。通過對細胞瞬間的快速測定，判斷細胞所處的細胞周期時相，并分析群體細胞中處于不同周期時相的細胞比例，以研究細胞的周期，DNA 復制和染色體倍性等。在腫瘤學研究中尤其常用，可以此來判斷藥物對腫瘤細胞影響、腫瘤的生長速度與患者預后等。
③Th/Treg檢測
通過刺激阻斷劑對 T 細胞進行處理，通過檢測表面或胞內標志物進行分型檢測。
④免疫分型檢測
利用細胞表面或細胞內特異性抗體分子，分別選用不同標記的流式抗體對細胞進行分型和分析。
利用抗原/抗體反應原理，采用不同的流式抗體對樣本進行檢測可達到對不同細胞進行分型檢測的目的。
⑤細胞因子檢測
采用 CBA 或液相芯片的方法將捕獲抗體和微球/液相芯片結合，檢測抗體和 SA-PE 結合通過抗原抗體特異性反應達到多種細胞因子檢測的目的。
⑥細胞分選
細胞分選利用流式細胞分選儀來分離純化細胞或顆粒以供進一步分析。
⑦其他
其他還包括死/活細胞檢測、線粒體檢測、外泌體檢測。
02
流式細胞術臨床應用
①淋巴細胞亞群分析
淋巴細胞亞群分析可以了解機體在不同條件下的免疫功能狀態，主要包括細胞免疫功能和體液免疫功能。在臨床上，主要用于對免疫系統造成明顯干擾的相關疾病的輔助診斷，分析疾病的發病機理，監控疾病的病程進展，觀測療效及監測預后等等。
主要檢測項目：淋巴細胞亞群（TBNK）、T 淋巴細胞分型、調節性 T 細胞（Treg）檢測等。
②HLA-B27 檢測
強直性脊椎炎患者其 HLA-B27 抗原表達為陽性，為強制性脊柱炎的重要標志物，因此 HLA-B27 的檢測在疾病的診斷中有著重要意義。
③白血病免疫分型
白血病的免疫分型已成為診斷血液惡性腫瘤不可缺少的重要標準之一。國際上公認的通用的方法是流式細胞術（FCM）。FCM 分析白血病免疫表型具有快速、特異、準確，重復性好，能區分細胞起源、劃分其分化發育階段等，對白血病的診斷與分型、治療方案選擇與預后判斷、發病機理研究等有重要價值。
主要檢測項目：急性白血病、慢性淋巴增生性疾病（CLD）/淋巴瘤等檢測
④造血干細胞分析
造血干細胞移植已被廣泛用于治療各種惡性血液疾病、遺傳性疾病、實體腫瘤、重癥聯合免疫缺陷病等。移植后造血功能的重建主要取決于輸入造血干細胞的數量和質量。臨床上快速而準確地檢測移植物中造血干細胞水平，能夠確保移植成功，在造血干細胞移植中有重要意義。CD34 分子為造血干細胞的表面特異性標志物，可用于造血干細胞計數。
⑤細胞因子檢測
細胞因子是由免疫細胞（由單核、巨噬細胞、T 細胞、B 細胞、NK 細胞等）和某些非免疫細胞（內皮細胞、表皮細胞、纖維母細胞等）經刺激而合成、分泌的一類具有廣泛生物學活性的小分子蛋白。通過對多個細胞因子的相關性分析，可達到對機體免疫狀態進行整體評估，進而更好地為醫師提供有價值的輔助診斷信息，為患腫瘤、免疫性疾病以及感染性疾病的患者制定更加有效的治療方案。
⑥其他
細胞分選利用流式細胞分選儀來分離純化細胞或顆粒以供進一步分析。其他還包括：陣發性睡眠性血紅蛋白尿癥（PNH）診斷 （CD55/CD59 檢測）、血小板相關分析（血小板計數、血小板免疫表型分析）、感染性疾病診斷（CD64 檢測）、程序性死亡受體-1（PD-1/CD279）檢測等。
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