實驗流程干貨|懸浮細胞檢測CCK8和MTT 小tips
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發表時間：2024-10-15
一、細胞
1.選擇適當的細胞接種濃度.
貼壁細胞:考慮到細胞大小不同，建議根據具體情況適當調整細胞的密度布局。
懸浮細胞:一般在96孔板中，每個孔放置10000個細胞，可通過細胞計數的方式來進行布板。
采用狀態很好的細胞去鋪版,傳代太多的細胞不宜拿來使用。鋪版如果太稀細胞的殺傷不會很明顯,太密細胞可能都會死掉,細胞密度多采用10000個/孔.100ul/孔
2.藥物濃度和處理時間的設定.
不同類型的細胞對藥物的敏感性存在差異。若藥物濃度未知，可查閱文獻，參考他人的研究結果來初步確定一個較大的范圍，計算藥物的半數抑制濃度（IC50），并根據IC50值來設定藥物的使用濃度。
3.培養時間.
如果要培養48h以上,就換液。(48h換液)
4.無菌操作
在進行MTT或CCK8實驗時，請務必進行無菌操作，因為一旦污染會嚴重影響吸光值的準確性。細菌污染也會導致比色反應的光密度值升高，給實驗結果帶來干擾。
5.設置對照
在實驗過程中，需要設置調零孔、對照孔和加藥孔。調零孔中應加入培養基、MTT或CCK-8以及DMSO；對照孔和加藥孔均需加入細胞、培養液和MTT或CCK-8。對照孔中需加入溶解藥物的介質，通常為DMSO，而加藥組則需要添加不同濃度的藥物。
6.設置副孔
每個處理組至少設置3個副孔,3-5個都可以.
二、實驗步驟
（1）需要做的操作包括收集對數期細胞、調節細胞懸液濃度在1萬至2萬個細胞/毫升之間，取100微升加入96孔板中。同時，對于96孔板的處理，需要在邊緣孔中使用無菌PBS或適當的培養基進行填充。在每個孔中，準備3至5個副孔。
（2）懸浮細胞鋪好板放37℃,5%CO2培養箱中靜置培養1小時,之后即可加藥。藥物建議現配現用,采用半比稀釋法,培養基配藥。(長期保存的藥物實用說明書規定的溶液配,例如DMSO,一次性使用的采用培養基稀釋藥物,達到最終使濃度。)
（3）置37℃,5%CO2孵育到藥物處理時間。
（4）在每個孔中加入10μL MTT 溶液（5mg/ml，即0.5% MTT），繼續培養4小時。也可以考慮使用CCK-8 替代 MTT，更加方便。
（5）經過4小時處理后，每個孔加入100ul MTT緩沖液，反應至指定時間，以確保結晶物充分溶解。隨后，使用酶聯免疫檢測儀在OD 570nm（經過630nm校準）下測量各孔的吸光值。
三、MMT的配制
我通常建議現配現用MTT，并在過濾后于4℃避光保存。配制好的MTT需要保持無菌，因為MTT對細菌非常敏感。添加到96孔板時可以不避光，或者將操作臺上的照明燈關閉。在配制MTT時，我們建議使用PBS溶解，并在60℃水浴中輔以超聲處理以幫助溶解。
四、加入MMT
MTT的添加量寧多勿少，10 μl足矣。若某些孔在加入MTT后立即呈現藍黑色，則說明可能受到污染。在加入MTT之前，建議先在顯微鏡下觀察，查看是否存在孔內的細胞受到了細菌污染。
CKK8使用方法
1、將100ul細胞懸液接種至96孔板中，并置于預熱至37℃、5% CO2飽和濕度的培養箱內進行培養。
2、向每個孔中添加10ul的CCK-8試劑。
3、將培養板放入培養箱中培養1-4小時。
4、在450nm波長下測定吸光度，參考波長設定為600nm以上。
OD值的測定
細胞密度較高時測得的吸光度也會偏高，而細胞密度較低時吸光度則會偏低。此外，吸光度值也與細胞狀態相關，細胞狀態不佳時吸光度值通常較低。細胞數量較少或培養時間較短時，OD值也會偏低。若各孔之間的差異性明顯，可能存在污染現象，如空白孔的OD值異常高，則很可能是受到細菌污染的影響。
為了確保實驗的準確性，通常會為每個濃度設置5-6個復制孔。在最終統計數據時，可以排除一個最高值和一個最低值，或者剔除那些可能出現的異常數值。這些異常數值的出現可能與多種因素有關，如細胞污染情況、細胞死亡情況、培養液蒸發程度、MTT液的準確使用，以及在37℃和5%二氧化碳的培養箱中孵育時間是否恰當（通常為1-4小時）。這些因素之間存在著緊密的關聯。
五、注意事項
1.建議控制細胞的接種密度，尤其對于懸浮細胞。一般來說，每孔10000個左右的細胞數量是合適的，不要過多。特別是對于腫瘤細胞，更要注意避免過高的接種密度，寧少勿多。這樣可以確保實驗結果的準確性和可靠性。
2."對于MTT和CCK-8實驗來說，它們本身就是相對粗略的實驗方法，因此在結果中出現小幅波動或誤差屬于正常現象。"
3.在進行鋪板時，務必確保細胞懸液充分混合，并且如果長時間靜置，需要用槍頭重復吹打幾次來達到混合均勻的效果。如果細胞分布不均勻，會導致每孔中的細胞數量不一致，建議每接幾個孔就進行混勻操作。移液槍的操作需要熟練，盡量避免不必要的誤差。另外，過多的吹散次數也會影響細胞的活力，因此請盡快完成鋪板操作。
4. 在進行吹打操作時，需要注意細胞懸液的總量不宜過多。過多的懸液不僅容易造成污染，同時也會導致細胞團不易被吹散。建議將細胞懸液控制在6-7ml左右為宜。若懸液量過少，容易產生大量氣泡，影響實驗的進行。
5.吸液時應將吸頭放置于懸浮液底部，稍微提起一點，而在吹液入管時則要保持接近液面，以避免產生氣泡。
6.每塊板加完后記得晃動培養板,使得細胞能分散的均勻些,鋪好板之后精置2min,靜下觀察細胞分布均勻度以及每孔細胞量是否大概一致。
7.免邊緣效應指的是在96孔板中，四周一圈的孔通常只用作空白對照，不應該培養細胞，否則這四排數據可能會出現偏高或偏低的情況。在最外側一圈的孔中，務必添加水、PBS或培養液，只要能夠有效防止蒸發即可。
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