如何做好β-半乳糖苷酶染色！
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發表時間：2024-10-15
結果β-半乳糖苷酶染色（β-Galactosidase Staining）是一種常用的細胞或組織活性檢測方法。這種染色方法基于衰老時SA-β-Gal（senescence-associated β-galactosidase）活性水平上調，可以對衰老細胞或組織進行染色檢測。在普通的光學顯微鏡下就可以觀測到細胞或組織的衰老情況。
不同類型樣本實驗操作
1. 細胞樣本染色
1
貼壁細胞
① 對于 6 孔板中培養的細胞，吸除細胞培養液，用 PBS 或 HBSS 洗滌 1 次，加入 1 ml 染色固定液，室溫固定 15 分鐘。
② 吸除固定液，用 PBS 或 HBSS 洗滌細胞 3 次，每次 3 分鐘。
③ 吸除 PBS 或 HBSS，每孔加入 1 毫升 SA-β-gal 染色液。
④ 37 ℃ 孵育過夜，可以用保鮮膜封住防止染色液蒸發。
⑤普通光學顯微鏡下觀察。如不能及時觀察計數，可以去除染色工作液，加入 2 ml PBS，4 ℃ 可以保存數天；或者加上封片液封片后，4 ℃ 可以保存較長時間。
2
懸浮細胞
① 離心收集細胞至 1.5 ml 離心管內，用 PBS 或 HBSS 洗滌 1 次，加入 1 ml 染色固定液，室溫固定 15 分鐘。固定時可以在搖床上緩慢搖動，以避免細胞結成團塊。
② 離心，吸除細胞固定液，用 PBS 或 HBSS 洗滌細胞 3 次，每次 3 分鐘。
③ 離心，吸除 PBS 或 HBSS，每管加入 0.5~1 毫升 SA-β-gal 染色液。
④ 37 ℃ 孵育過夜。
⑤ 取部分染色后的細胞，滴加到載玻片上或孔板內，普通光學顯微鏡下觀察。如不能及時觀察計數，可以離心，去除染色工作液，然后加入 1 ml PBS，4 ℃ 可以保存數天。如果離心，取細胞用于涂片，加上封片液封片后，4 ℃ 可以保存較長時間。
2. 石蠟切片樣本操作
① 將石蠟組織切片置于65°C恒溫箱，烤片1h左右。脫蠟。二甲苯I10min→二甲苯II10min→梯度酒精(由高到低)各5min。
② 1xPBS洗滌3次，每次3-5min。
3. 冰凍切片樣本操作
① 加入適當體積的-半乳糖苷酶染色固定液，以充分蓋住組織為宜，室溫固定不少于15min。1xPBS洗滌3次，每次5min，吸除PBS或HBSS。
② 加入適當染色工作液，37℃孵育過夜，最好把整個切片浸泡在染色工作液中。
注意：37℃孵育不能在二氧化碳培養箱中進行。
③ 1xPBS洗滌3次，每次5min
④ 脫水:梯度酒精(由低到高)各5min→二甲苯I10min→二甲苯II10min
⑤ 中性樹膠封片。
⑥ 普通光學顯微鏡下觀察。光學顯微鏡下很容易觀察到變成藍色的表達-半乳糖苷酶的細胞如不能及時觀察計數，可以去除染色工作液，加入2mlPBS，4℃保存。
常見問題及注意事項
1. 細胞樣本染色
1. β-Gal?Fixative有一定的腐蝕性和氣味，操作時請注意防護。
2
片子有大量雜質
① 工作液需要完全融化，必要時可在 37 ℃ 烘箱中溶解，現用現配，低溫會使工作液再次結晶。
② 試劑盒可能過期變質；可用 70% 乙醇輕柔沖洗幾次。
3
染色過深或過淺
染色時間、分化時間過長或不夠，染色過程可在鏡下控制，適當調整時間。
4
切片染色不均
① 取材固定不當，取材規范標準，固定徹底；脫水不夠，重新脫水、透明、浸蠟。
② X-Gal溶液需要現用現配。細胞固定時間過長或固定之后清洗不干凈，均會影響后續的酶反應。
5
樣品固定要求
樣本放置于20倍樣本體積的固定液中固定24小時以上，固定時樣品切勿冷凍結冰。
運輸要求：固定好的樣品常溫運輸送樣；冰凍切片-20℃運輸。
6
染色液的配制
染色液應該在無菌環境下配制，以避免污染。使用聚丙烯容器配制染色工作液，不能使用聚苯乙烯容器配制，例如普通的6孔板就可以用作染色的容器。加入染色液后，可能有結晶形成影響觀察，可去除染色液后，用 70% 乙醇洗滌，待結晶溶解后換成 PBS，再觀察。
7.β-半乳糖苷酶染色反應依賴于特定的pH條件，不能在二氧化碳培養箱中進行染色反應。用于細胞培養的二氧化碳培養箱中較高濃度的二氧化碳會影響染色工作液的pH值，而導致染色失敗。
結果β-半乳糖苷酶染色（β-Galactosidase Staining）是一種常用的細胞或組織活性檢測方法。這種染色方法基于衰老時SA-β-Gal（senescence-associated β-galactosidase）活性水平上調，可以對衰老細胞或組織進行染色檢測。在普通的光學顯微鏡下就可以觀測到細胞或組織的衰老情況。
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