實驗干貨 | qPCR實驗中經常忽略的實驗細節！
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發表時間：2024-10-15
在實驗室的日常實驗中，每一個細節都可能對結果產生重要影響，尤其是在進行實時熒光定量PCR(qPCR)實驗時更是如此。繁忙的實驗過程中，我們往往容易忽略一些看似微不足道但卻至關重要的步驟。因此，不妨讓我們一起回顧并重視那些常常被忽略的實驗細節，確保實驗結果的準確性和可靠性。
01
如何評判RNA質量？評判RNA質量是分子生物學實驗中的一個關鍵步驟，尤其在涉及RNA測序、cDNA合成、qPCR等實驗時，RNA的質量直接影響到實驗結果的可靠性和準確性。以下是評判RNA質量的主要方法和步驟：
1. 純度評估
紫外光譜法:
260/280比值: 理想范圍為1.8到2.1，表示RNA樣本中蛋白質污染較少。
260/230比值: 理想范圍為2.0到2.2，表示RNA樣本中有機物和鹽類污染較少。熒光染料法:
使用如Qubit等熒光染料，特異性結合RNA，以熒光信號強度定量RNA濃度，具有較高的靈敏度和準確性。
2. 完整性評估
瓊脂糖凝膠電泳 :
通過電泳分離RNA片段，觀察28S和18S rRNA帶。28S rRNA帶應約為18S rRNA帶的兩倍強度，如果兩者之間的比例失調或出現降解產物條帶，說明RNA有降解。毛細管電泳 和Bioanalyzer:
使用Agilent Bioanalyzer或類似設備，可以更精確地評估RNA質量。通過電泳圖譜和RNA完整性數值 (RNA Integrity Number, RIN) 評估RNA完整性。RIN值在1到10之間，值越高表示RNA越完整，通常RIN值大于8被認為是高質量的RNA。
3. RNA質量控制 (QC)指標
RNA降解產物分析:通過電泳圖譜中小片段RNA的分布情況來判斷RNA是否有明顯的降解。qPCR分析:通過qPCR分析多個內參基因的表達情況，評估RNA樣本的一致性和質量。
4. RNA純化
柱式純化法:使用如Trizol試劑或RNA提取試劑盒，通過裂解、分離和純化步驟，獲得高純度的RNA。酶處理:使用DNase去除RNA樣品中的DNA污染，確保RNA的純度。
02
基因組DNA殘留會導致定量結果不準確
基因組DNA（gDNA）殘留是分子生物學實驗中一個常見的問題，特別是在RNA提取過程中，如果樣本中存在未徹底去除的gDNA殘留，會對后續的定量PCR（qPCR）或逆轉錄定量PCR（RT-qPCR）結果產生顯著影響。以下詳細介紹基因組DNA殘留會導致定量結果不準確的原因及其影響。
基因組DNA殘留對定量結果的影響：
假陽性結果:在RT-qPCR實驗中，目標是定量特定基因的mRNA表達水平。如果樣本中含有gDNA殘留，gDNA可能包含與目標mRNA相同的序列，這會導致在沒有實際mRNA表達的情況下，PCR擴增出特異性產物，從而產生假陽性結果。
定量偏差:gDNA的存在會影響熒光信號的準確性，從而影響定量結果。因為qPCR依賴于熒光信號強度來測定起始模板的數量，gDNA殘留可能會導致熒光信號增加，結果表現為目標基因表達水平被高估。
Ct值偏移:在qPCR中，循環閾值（Ct值）是一個關鍵參數，表示檢測到熒光信號的循環次數。gDNA殘留會導致Ct值降低，即在更早的循環中檢測到信號，這會影響結果的準確性和可靠性。
避免gDNA殘留的方法
使用DNase處理樣品:在RNA提取過程中加入DNase酶處理步驟，能有效降解樣本中的gDNA。常用的DNase如Turbo DNase，可以在RNA提取后的純化過程中使用。
設計跨內含子引物:在qPCR實驗中，設計跨越內含子的引物，這樣即使有gDNA殘留，因其不含內含子，無法被擴增出來，從而避免了gDNA干擾。
使用特異性引物和探針:設計特異性引物和探針，確保只針對目標mRNA序列，這有助于減少gDNA干擾。
優化RNA提取步驟:在RNA提取過程中，嚴格按照操作規程進行，確保樣本處理的徹底性，減少gDNA殘留的可能性。
檢測gDNA殘留的方法
陰性對照:設置無逆轉錄酶（no-RT）陰性對照，僅含有RNA樣本和qPCR反應成分，但不含逆轉錄酶。如果在此對照中檢測到特異性擴增產物，說明樣本中存在gDNA殘留。
引物驗證:使用設計好的引物，在樣本中進行PCR擴增，并使用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物。如果出現與gDNA相應大小的條帶，則表明樣本中含有gDNA殘留。
gDNA檢測試劑盒:一些商業試劑盒專門用于檢測樣本中的gDNA殘留，可以快速且精確地評估樣本中的gDNA污染情況。
03
逆轉錄引物的選擇
隨機引物: 可以逆轉錄所有RNA分子，適合未知RNA的初步研究。但可能導致cDNA片段長度不一致。
oligo(dT)引物:僅逆轉錄mRNA，適合研究多種mRNA轉錄本。但無法逆轉錄沒有poly-A尾的RNA。
基因特異性引物:只逆轉錄特定的RNA序列，適合定量特定基因。但可能需要多次逆轉錄反應來檢測多個基因。
選擇適合的逆轉錄引物:根據實驗目的選擇合適的逆轉錄引物，確保逆轉錄效率和特異性，以便后續的qPCR定量準確可靠。
04
qPCR反應體系配制
反應體系的均一性:
使用新鮮配置的qPCR反應體系，避免長時間儲存導致反應效率下降。
嚴格按照反應體系的體積比例配制，確保反應成分的均勻分布。
使用預混合（master mix）試劑盒，減少配制誤差。使用無核酸酶的試劑和耗材:
使用RNase/DNase-free的試劑和耗材，避免外源核酸酶污染。反應組分的優化:
優化MgCl2濃度、引物濃度和dNTP濃度，確保最佳擴增效率。
05
反應條件優化
退火溫度的優化:
通過梯度PCR確定最佳退火溫度，提高反應特異性和效率。擴增效率的檢測:
繪制標準曲線，計算擴增效率，確保在90-110%之間。低于或高于此范圍的擴增效率會影響定量結果的準確性。使用適當的循環數:
通常40個循環足夠檢測到低豐度的RNA，避免過多循環導致非特異性擴增。
06
實驗設置與數據分析
實驗設置:
設置標準曲線: 使用已知濃度的模板，繪制標準曲線，確保定量結果的準確性。
設置陰性對照: 包含no-template control（NTC）和no-RT對照，檢測樣品中是否有污染或gDNA殘留。
設置陽性對照: 包含已知濃度的陽性模板，驗證反應體系和引物的有效性。數據分析:
Ct值的準確判定: 確保Ct值在檢測范圍內，并剔除異常值。
擴增曲線分析: 確保擴增曲線的形狀符合標準S形曲線，避免非特異性擴增。
熔解曲線分析: 檢查熔解曲線的單一峰值，驗證擴增產物的特異性。
07
儀器校準與維護
儀器校準:
定期校準qPCR儀器，確保溫度控制和熒光檢測的準確性。
使用校準標準品，驗證儀器的性能。儀器維護:
定期清潔和維護qPCR儀器，確保反應孔板、熒光檢測系統和光學系統的清潔。
遵循制造商的維護指南，定期更換耗材和檢測系統部件。
總結
在qPCR實驗中，細節決定成敗。選擇合適的逆轉錄引物、嚴格配制反應體系、優化反應條件、設置合理的實驗對照和嚴格的數據分析，以及定期校準和維護儀器，都是確保qPCR實驗結果準確可靠的關鍵步驟。只有關注這些細節，才能獲得高質量的qPCR數據，確保實驗的成功。
主營項目
1
動物實驗
動物飼養、疾病造模、行為學檢測、心功能、無創血壓、血常規、全自動生化檢測等
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細胞實驗
CCK8/MTT、原代細胞分離、流式細胞實驗、細胞劃痕、侵襲、遷移、EDU染色、轉染、穩定株
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分子生物學
PCR檢測、熒光定量PCR、絕對定量PCR、端粒酶長度、pull down、雙熒光素酶、SSR、SNP檢測等
4
蛋白實驗
WB、Co-IP、酵母雙雜
5
病理實驗
HE染色、免疫組學、電鏡
6
生理生化實驗
肝腎功能、抗氧化、免疫反應等生理免疫指標;動植物營養指標、微量元素、重金屬、酶活等。
7
多組學實驗
基因組、轉錄調控、蛋白組、代謝組、微生物多樣性、宏基因組、生信分析
8
整體課題實驗
方案設計、整體實驗交付、標書寫作、論文潤色、協助投稿
END
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