流式細胞周期檢測的那些問題
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發表時間：2024-10-15
樣本制備注意事項
1、根據不同的檢測細胞調整合適的溫度、濕度、酸堿度等培養環境，注意一定要無菌的環境培養。
2、培養細胞時，以對數期處理為宜，避免細胞量過少導致收集細胞量不足或者細胞量過多導致細胞開始大量死亡造成的實驗誤差。
3、流式檢測細胞周期上機檢測所需收集細胞量較多，收集細胞時盡量多收集一些
4、流式檢測對細胞離心，重懸次數較多，注意動作輕緩，避免過多地損傷、弄破細胞。
5、本實驗對細胞離心，重懸次數較多，注意動作輕緩，避免過多地損傷細胞。
6、細胞周期待測細胞盡量要獲得單個細胞，避免DNA的降解。
7、樣本最關鍵的就是減少碎片(EDTA/不可過度吹打/離心rpm)。PI既能與DNA結合，又能與RNA結合，所以要用RNase降解。PI質量及RNase所加量很重要，建議用商品化試劑。
8、污染脫氧核糖核酸酶會降解DNA，故玻璃器皿和試劑要干凈滅菌。
9、染液等物質有一定毒性，注意防護。
流式檢測時的注意事項
01
固定時必須預冷PBS重懸打入無水乙醇中，做到隨加隨混勻，避免細胞形成團塊。
02
固定后細胞雖然可以保存較長時間后再上機檢測，為避免不可控因素影響最好盡早上機檢測。
03
進樣速度：一般檢測細胞濃度調整為2*10^5到2*10^6/ml，建議進樣速度為低速。若峰形較寬、CV較大，可能就是進樣速度太快。
04
儀器質控定期做，檢查質控微球的CV值，盡可能排除因機器設置引起的峰形加寬。
05
通過電壓脈沖信號的寬度、高度、面積等參數區別實體組織標本中的粘連細胞群體，最大程度的減少粘連細胞帶來的假陽性結果。
06
選擇合適的細胞系，不同的細胞系由于細胞形態、直徑等不同，會對結果的美觀程度有一定的影響，筆者常用HeLa細胞系，峰形較細，周期各階段明顯區別，結果美觀。
07
建議選擇6孔板操作，細胞給藥密度在40%左右，給藥時間不一定要與蛋白印跡法給藥時間一致。這是由于蛋白印跡法檢測的是蛋白表達的變化，例如給藥10小時，蛋白上可見明顯變化趨勢，但10小時收樣時，孔內細胞已經明顯觀察到細胞漂浮凋亡，那對流式檢測的結果會有很大的影響。流式細胞術收樣時，盡量保證孔內細胞還未漂浮。
08
收樣時，如果孔內已經有細胞漂浮，細胞上清懸浮液也要收集。建議選用胰酶消化，消化時間必須嚴格控制，及時終止消化，消化時間太久，容易對細胞造成損傷和死亡。
09
收集細胞時，離心機選用4℃，300-500g離心5分鐘，小心吸去上清。加入0.3 mL預冷的PBS，將管內的細胞混勻后，再加入0.7 mL預冷的無水乙醇，4℃固定過夜。整個收樣過程中，不要用槍頭劇烈吹打細胞，一是會損傷細胞，二是造成細胞損失。
10
上機前，離心機選用4℃，300-500g離心5分鐘，棄去上清。此時格外需要注意的是由于不同時期細胞的重量不一樣，離心后細胞不是全部沉淀在管底，管壁上也會存在大量細胞，去上清一定要注意。加入100 μg/mL的PI染色液，避光染色15分鐘以上，上機測試前最好使用200目篩網過篩，以免細胞聚集堵塞機器管道。
細胞周期檢測常見問題解答與處理
問
細胞量太少，得不到數據結果白做了咋辦?
答
待測的細胞已經制備完了太少不容易挽救，正確的操作方法如下:
1)要保證收集足夠的細胞樣品(個人經驗至少收集100萬左右);如果藥物處理后細胞死亡過多，應該降低藥物濃度;
2)固定細胞時先用預冷的PBS 重懸細胞，再逐滴滴入無水乙醇中;
3)細胞清洗時，不可過度吹打細胞，以防產生過多的細胞碎片;
4)最后，盡量采用尖底的離心管和水平的離心機，離心后盡量用移液槍吸走上清，不要傾倒，殘留一點，不要吸完。
問
可不可以用70~75%乙醇直接固定細胞，反正乙醇固定細胞的終濃度也是這么多?
答
不可以，直接用70~75%乙醇加入很容易導致細胞聚團現象，很難重懸成單細胞，影響固定效果，甚至容易導致固定后無細胞沉淀的現象。
正確做法是:待細胞充分分散成單細胞后，緩慢地滴入無水乙醇中，使其終濃度為70~75%乙
醇。
問
在測定細胞周期的時候,由于固定、消化等處理后會出現很多細胞碎片，影響測量結果，無法找到G1期細胞群怎么辦?
答
在測定細胞周期的時候，除了設苦好獲取數據的模版外，另外設置直方圖，測量模式為線性放大，調整放大倍數，使二倍體峰出現在橫坐標50道的位置，就很容易的找到了二倍體峰和細胞周期個時相細胞的分布情況。
問
做流式分析細胞周期時，收集了10^6左右的細胞，但是固定后沒有細胞沉淀，甚至 PBS 洗滌后上機已經沒有細胞了，哪個環節出了問題?
答
確定收集了足量細胞但是沒有細胞沉淀且上機沒看見待測細胞的話，應該洗滌過程中細胞丟失了。
1)盡量采用尖底的離心管和水平離心機
2)離心后盡量用吸管吸取上清，不要傾倒，吸上清時最好殘留1mm左右的水膜，不要吸完。
3)離心的轉速或時間可以適當增加。
4)每次加試劑時，吸頭最好不要接觸液面，混勻時最好不要用吸頭吹打，以免吸頭掛壁帶走部分細胞。
問
什么樣的數據可以用?
答
1)G2/M期細胞的DNA 含量是G1期的2倍，在直方圖上形成一個2倍于G1信號峰的高斯峰。
2) CV(變異系數)表示峰的寬度，CV值越小，峰形越好，最好是在5%左右，一般小于10%也被認可。
3) RCS 最好是在1~3，高于5則不被認可。RCS高，說明數據的分布和軟件所建立模型的預期值的差別比較大，可能由于處理細胞的時候RNA 酶消化不好，或者是PI的濃度不佳造成的。
問
怎樣提高實驗結果的分辨率和精確度?
答
變異系數(Coefficient of Variation，CV值)反映G0/G1峰分辨率和精確度。而樣品 CV值為樣品固有，與樣本制備過程中細胞質量有關。細胞碎片越少、細胞聚團越少、RNA酶消化越充分，可以減少樣本的CV值，提高 G0/G1峰分辨率和精確度。
主營項目
1
動物實驗
動物飼養、疾病造模、行為學檢測、心功能、無創血壓、血常規、全自動生化檢測等
2
細胞實驗
CCK8/MTT、原代細胞分離、流式細胞實驗、細胞劃痕、侵襲、遷移、EDU染色、轉染、穩定株
3
分子生物學
PCR檢測、熒光定量PCR、絕對定量PCR、端粒酶長度、pull down、雙熒光素酶、SSR、SNP檢測等
4
蛋白實驗
WB、Co-IP、酵母雙雜
5
病理實驗
HE染色、免疫組學、電鏡
6
生理生化實驗
肝腎功能、抗氧化、免疫反應等生理免疫指標;動植物營養指標、微量元素、重金屬、酶活等。
7
多組學實驗
基因組、轉錄調控、蛋白組、代謝組、微生物多樣性、宏基因組、生信分析
8
整體課題實驗
方案設計、整體實驗交付、標書寫作、論文潤色、協助投稿
END
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