干貨：細胞培養保姆級實戰攻略
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發表時間：2024-10-15
干貨：細胞培養保姆級實戰攻略
細胞是生物細胞學實驗的基礎，藥物、基因功能、疾病機理等的相關研究多數需要在細胞水平進行闡釋。而細胞培養，受人員操作和環境條件的影響比較大，在細胞培養中常常會遇到很多的細節問題，而每個問題都有可能導致細胞培養的失敗。我們匯總了細胞實驗室多年來的細胞培養經驗分享給大家，希望能給大家的細胞培養提供參考。
01
細胞系身份需明確
我們之所以選定某種細胞系開展實驗，是因為所選細胞系的一些特性符合研究方向的設定。比如組織特性，疾病特性，功能特性，基因表達特性等。一旦用錯了細胞株，對我們研究結果的判斷就會帶來很大的誤差和不確定性。
而近年來，多個權威機構發現細胞系在培養和流通過程中，出現了很嚴重的交叉污染。據不完全統計，單就HeLa細胞系導致的污染致使3萬多篇論文結果的準確性存在問題，而這種情況不僅僅限于HeLa細胞。多個權威機構研究人員檢測發現超過451個細胞系已被其它細胞完全吸收，在所檢測細胞中污染占比46%，可見細胞交叉污染的現象非常普遍。因此，做實驗前對細胞株驗明正身非常重要。如果是在機構購買的細胞株，最好能讓供方提供合格的STR鑒定報告。
目前，STR基因分型方法是進行細胞交叉污染和性質鑒定的最有效和準確的方法之一，是ATCC等權威機構認定的金標準。不過可惜的是并非所有細胞均可進行STR鑒定，目前只有大部分的人源細胞株和45個種類的小鼠細胞株可以進行鑒定。其他細胞株可以結合細胞形態、特性和物種鑒定來進行確認。
02
培養、傳代、凍存和復蘇
1.準備工作：
根據培養細胞的特性，提前準備好適合的培養基和血清等。最好沿用細胞原來的培養條件，以免細胞在新環境下還需要過渡適應。同時，充分了解到細胞的生長特性和形態特征，便于后續的培養觀察。
2.貼壁細胞傳代：
1）移棄使用過的細胞培養液。（不要直接倒掉，避免瓶口殘留導致易污染）
2）使用不含鈣鎂離子的平衡鹽溶液（PBS）沖洗細胞。從與貼壁細胞層相對的容器一側輕輕加入沖洗液，以避免攪動細胞層，前后搖晃容器數次，最后移棄沖洗液。（洗去殘留的血清，避免影響胰酶的活性。）
3）以 25 cm2的培養瓶為例，向瓶內加入1ml胰蛋白酶-EDTA（請根據各細胞的指引使用合適的濃度）消化液，輕輕搖動培養瓶，使消化液流遍所有細胞表面，放到37 ℃ 孵育。通常，幾分鐘內，會發現胞質回縮、細胞間隙增大，傾斜培養瓶時細胞層能自然流下，此時應加入2-3ml含血清的完全培養液終止消化（細胞解離所需時間請參考各細胞的指引，并建議每隔30秒在顯微鏡下觀察細胞的解離情況）。另外，并不是所有貼壁細胞都適用采用胰蛋白酶進行解離，請根據各細胞的指引選擇合適的解離方法。
4）使培養瓶傾斜，吸取培養瓶內液體輕輕沖向原細胞生長表面，重復該動作2-3次，使所有細胞沿瓶底流下，再輕柔地把細胞吹打成單個懸液（吹打過程中應避免氣泡的產生）。
PS：對于難消化的細胞，盡量不要通過用力吹打的方式來處理，以免對細胞產生物理損傷。可以先將已經消化的細胞分出來，及時終止消化。然后再對仍然貼壁的細胞進行再次消化。做到分層消化，避免易消化細胞長時間在胰酶消化下受損。
5）把所有的細胞懸液轉移到15ml離心管中，800-1000rpm離心3-5分鐘后移棄上清。
6）加入新的含血清完全培養液重懸成單細胞懸液。按各細胞指引推薦的傳代比例，把細胞懸液均勻分到各培養器皿中，補足新的含血清完全培養液，輕輕搖晃混勻。
7）放到37 ℃ 孵育，第二天顯微鏡下觀察細胞的貼壁情況。
3.懸浮細胞傳代：
因懸浮生長細胞不貼壁，故傳代時不必采用酶消化方法，而可直接傳代或離心收集細胞后傳代。
1）直接傳代時，靜置5-10分鐘，待懸浮細胞慢慢沉淀到器皿底部后，吸掉1/2-2/3原培養液，補足新鮮的含血清完全培養液，混勻成細胞懸液。按各細胞指引推薦的傳代比例，把細胞懸液均勻分到各培養器皿中，輕輕搖晃混勻。
2）離心傳代時，將細胞連同培養液一并轉移到離心管內，800-1000rpm離心3-5分鐘，移棄上清后，加入新鮮的含血清完全培養液重懸。按各細胞指引推薦的傳代比例，把細胞懸液均勻分到各培養器皿中，補足新鮮的含血清完全培養液，輕輕搖晃混勻。
3）放到37 ℃ 孵育，第二天顯微鏡下觀察細胞的情況。
4.貼壁懸浮混合型細胞傳代：
先將懸浮的細胞收集，再參考“貼壁細胞傳代”方法進行消化收集，一起接種到培養器皿中。
PS: 懸浮細胞生長中一般對細胞密度要求比較高，培養中最好參考指南控制好細胞密度，不能過密也不能過稀。
5.細胞凍存：
1）按照“細胞傳代步驟”中的方法收集細胞。
2）加入細胞凍存液（一般10%DMSO+對應細胞的完全培養液），使細胞的終密度為(5~10)×105個/ml，移入細胞凍存管中。
3）程序降溫（以使用需異丙醇的Nalgene程序降溫盒為例）：4℃ 30min→-80℃過夜→液氮。（一定不能省略4℃的30min，否則凍存液無法滲透到細胞，易產生冰晶導致細胞受損。）
6.細胞復蘇：
1）取出貯存的細胞，待液氮揮發后，馬上37℃水浴中輕輕搖動使快速融化（通常2min內，時間長了細胞狀態會受影響）。為避免劇烈的溫差變化導致凍存管炸裂，操作該步時請配戴防護面罩或防護目鏡。
PS：干冰運輸的凍存細胞，收到后需要立刻放入深低溫冰箱或液氮中，至少3d后再進行復蘇操作。
2）轉移到無菌操作臺，75%酒精擦拭凍存管外部。
3）將細胞懸液轉移到裝有10-20ml經預熱的含血清完全培養液離心管中，800-1000rpm離心3-5分鐘，移棄上清。
4）重新加入經預熱的含血清完全培養液重懸細胞，以約(3~5)×105個/ml密度接種到培養器皿中。
5）放到37℃孵育，第二天顯微鏡下觀察細胞的情況。
03
污染防治
1.細菌污染
細菌污染是細胞培養中最常見的污染，主要由操作不慎或使用了滅菌不完全的耗材與試劑引入。最常見的有枯草桿菌、大腸桿菌、假單胞菌及白色葡萄球菌。鏡下形態則為長桿狀、短桿狀和顆粒狀等。
左邊的就是比較典型的桿菌污染，一般桿菌會延軸向快速游動，量少時培養基澄清。右圖是顆粒狀污染，一般培養基會渾濁或有白色沙狀沉淀。
好氧菌增殖分裂迅速，感染24h內即可使培養基渾濁；厭氧菌在常規細胞培養條件下增殖緩慢，需要較長時間才會觀察到渾濁現象。
污染處理：由于國內細胞培養中抗生素使用泛濫，所以出現污染后加雙抗（青霉素&鏈霉素，Penicillin + Streptomycin）一般沒有效果。桿菌可選用100ug/ml慶大霉素處理一周，顆粒狀細菌可用25ug/ml環丙沙星處理一周，效果相對還不錯。
2. 真菌污染
細胞培養中最常見的污染真菌有：煙曲霉、黑曲菌、毛霉菌、白色念珠菌、酵母菌等。
左邊這張是比較典型的霉菌污染的圖片，右圖是酵母污染，鏡下可以看到明顯的出芽形態。
污染處理：可用100ug兩性霉素B/T25瓶，處理一周。
注：兩性霉素毒性較大，需要在細胞有50%以上且狀態沒受大影響前處理。
3.支原體污染
支原體的危害：支原體污染可以改變細胞的特性。例如部分支原體會快速消耗培養液中的精氨酸，與細胞競爭營養，從而使細胞的生長速度減慢或停止；同時支原體還可以改變細胞的酶譜、細胞膜成分，造成細胞染色體異常或細胞病理性改變等。上述情況會嚴重影響到使用這些細胞所做實驗的結果，導致結論不可靠。
（PCR法檢測細胞上清中的支原體污染）l
支原體的預防與清除：由于支原體無法在鏡下直接看到，需要通過PCR法等進行檢測才發現，出現污染后比較難發現。建議在養細胞每月檢測一次并結合每周抽檢，做到有污染早發現。對于正在進行支原體去除處理的細胞建議每周必檢，直至出現陰性結果并至少維持一月。不同的細胞分開處理，優先處理“支原體陰性”細胞，后處理正在做去除處理的和受感染的細胞。同時，新引進的細胞系都進行支原體檢測，確保不給實驗室帶來新的污染。
4.實驗室細胞污染防治
建立良好的規章制度對減少細胞污染會有很大的幫助。包括準入制度、操作規范和日常管理制度。
準入制度：包括了人員的和物料的。人員需要進行培訓之后才能自己進行操作，而且要符合穿戴要求才能進實驗室，如白大褂、隔離服，口罩，手套等。而所需用到的物品，非一次性的物品應嚴格消毒滅菌，而購買的物品需要從正規的、可靠的渠道購買。新買的細胞應檢測驗證后再使用。
操作規范：對于常規操作最好制定規范，且實驗室人員都要按操作規范進行，不能隨意更改，同時也是培養實驗人員的良好操作習慣。比如，槍頭滴管吸完就不再二次伸入培養基中吸取，一次吸夠足夠量的培養基。加液時也應盡量做到懸空加液，這些都可有效預防支原體污染和細胞交叉污染。另外可以的話，一次只操作一株細胞，細胞與細胞間最好有一點時間間隔，避免交叉污染。
日常管理制度：則包括環境及耗材試劑等的使用、清潔、保養等各方面的規則、方法。還有試劑耗材等的用量、庫存及采購等的管理，包括細胞樣品的兩級庫存管理。對于不易發現的污染源，最好定期進行檢測，主要是支原體污染和細胞交叉污染。
04
細胞培養常見問題匯總
新買的細胞
1.新買的或惠贈的細胞如何處理？
不管買的細胞、惠贈的細胞，剛拿到手應趕緊做這幾件事：檢測瓶子是否破裂；培養基是否漏出，是否渾濁；是否有支原體污染；迅速擴增凍存。
2.能否使用與原先培養條件不同的培養基？
不能。每一細胞株均有其特定使用且已適應的細胞培養基，若驟然使用和原先提供培養條件不同的培養基，細胞大都無法立即適應，造成細胞無法存活。
3.購買的細胞死亡或存活率不佳可能原因？
常見原因可能有：培養基使用錯誤或培養基品質不佳；血清使用錯誤或血清的品質不佳；解凍過程錯誤；冷凍細胞解凍后，加以洗滌細胞和離心；懸浮細胞誤認為死細胞；培養溫度使用錯誤；培養箱氣體濃度達不到要求；細胞置于 –80 ℃ 太久。
復蘇凍存的細胞
4.收到的冷凍管瓶身破裂，瓶蓋有裂紋，或瓶蓋脫落的原因？
冷凍管瓶蓋裂紋，或瓶身破裂，可能是因為操作者夾取冷凍管時用力不當，造成冷凍管裂損，建議使用止血鉗小心夾取。另冷凍管瓶蓋松動或松脫，是因熱脹冷縮的物理現象，冷凍管有可能因此而造成細胞污染，故冷凍管于放入和取出液氮桶時，均應立刻將冷凍管再一次扭緊。
5.冷凍管應如何解凍？
將冷凍管由液氮桶中取出解凍時，必須注意安全，可佩戴防護眼鏡和手套預防冷凍管的爆裂。取出冷凍管后，須立即放入 37 ℃ 水浴環境中快速解凍，輕搖冷凍管使其在 1 分鐘內全部融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細胞內形成胞內再結晶對細胞造成損害。并注意水面不可超過冷凍管蓋沿，否則易發生污染情形。
6.細胞冷凍管解凍培養時，是否應馬上去除 DMSO？
現在大多數實驗室會在解凍細胞后加培養液將DMSO除去，但也有研究者認為除少數特別注明對 DMSO 敏感的細胞外，絕大部分細胞株（包括懸浮性細胞），在解凍之后，可直接放入含有 10~15 ml 新鮮培養基的培養角瓶中，待隔天再置換新鮮培養基以去除 DMSO 即可，如此可避免大部分解凍后細胞無法生長或貼附的問題。
細胞培養用液
7.如何正確選擇培養基種類？
引用幾款比較經典的培養基舉例：
8.如何選用特殊細胞系培養基？
培養某一類型細胞沒有固定的培養條件。在 MEM 中培養的細胞，很可能在 DMEM 或 M199 中同樣很容易生長。總之，首選 MEM 做粘附細胞培養，RPMI-1640 做懸浮細胞培養是一個好的開始。
9.什么培養基中可以省去加酚紅？
酚紅在培養基中被用來作為 PH 值的指示劑：中性時為紅色，酸性時為黃色，堿性時為紫色。研究表明，酚紅可以模擬固醇類激素的作用（特別是雌激素）。為避免固醇類反應，培養細胞，尤其是哺乳類細胞時，用不加酚紅的培養基。由于酚紅干擾檢測，一些研究人員在做流式細胞檢測時，不使用加有酚紅的培養基。
10.細胞培養基的配制和儲存應該注意什么？
細胞培養基配好后，要先抽取少許放入培養瓶內在37℃培養箱內放置24~48h，已檢測培養液是否有污染，然后方可用于實驗。配置培養基所需的血清要合格并且保持穩定。一個批號試用效果良好后，就可一次購入較多同一批號的血清，這樣實驗條件穩定，配液時調整pH值較容易。每次配液量以使用兩周左右的量為宜，一次配液不要太多，一是短期內用不完造成營養成分損失需要補充，二是量大易造成污染。
11.為何培養基保存于 4 ℃ 冰箱中，顏色會偏紫色？
培養基保存于 4 ℃ 冰箱中，培養基內的 CO2 會逐漸溢出，造成培養基越來越偏堿性，而培養基中的酸堿指示劑 （通常為 phenol red） 的顏色也會隨堿性增加而更偏紫色。培養基偏堿的結果， 將造成細胞生長停滯或死亡。若培養基偏堿時，可以通入無菌過濾 CO2，以調整 pH 值。
12.什么情況下用到無血清培養基？
對于應用培養細胞進行分離制備細胞生長因子、單克隆抗體等應該選擇無血清培養基。
13.如何選擇正確的血清種類？
圖源：https://www.51xxziyuan.com/53/10434.html
14.可否使用與原先培養條件不同的血清種類？
不能。血清是細胞培養上一個極為重要的營養來源，所以血清的種類和品質對于細胞的生長會產生極大的影響。來自不同物種的血清，在一些物質或分子的量或內容物上都有所不同，血清使用錯誤常會造成細胞無法存活。
15.血清滅活是否必須？
一般情況下不建議。熱滅活是以 56℃，30 分鐘來處理已解凍的血清，因為此加熱步驟，可以使補體去活化，而補體所參與的反應有：溶細胞活性，平滑肌的收縮，肥大細胞和血小板組胺的釋放，增強吞噬作用，淋巴細胞、巨噬細胞的趨化和激活。
實驗顯示，經過正確處理的熱滅活血清，對大多數的細胞而言是不需要的。經此處理過的血清對細胞的生長只有微小的促進，或完全沒有任何作用，甚至通常因為高溫處理影響了血清的質量，而造成細胞生長速率的降低。而經過熱處理的血清，沉淀物的形成會顯著的增多， 這些沉淀物在倒立顯微鏡下觀察，像是 "小黑點"，常常會讓研究者 誤以為是血清遭受污染，而把血清放在 37C 環境中，又會使此沉淀 物更增多，使研究者誤認為是微生物的分裂擴增。因此除了做免疫學相關實驗和培養一些特定細胞，如平滑肌細胞、胚胎干細胞等，不需要做熱滅活處理。
16.培養基中是否添加抗生素？
除特殊篩選系統中外，一般正常培養狀態下，培養基中不應添加任何抗生素。
17.何時更換培養基？
視細胞生長密度而定，或遵照細胞株基本數據上的更換時間，按時更換培養基即可。
細胞傳代
18.細胞傳代的方法都有哪些？
根據不同的細胞采取不同的方法。貼壁生長的細胞用消化法傳代；部分貼壁生長的細胞用直接吹打即可傳代；懸浮生長的細胞可以采用直接吹打或離心分離后傳代，或用自然沉降法吸除上清后，再吹打。
19.原代培養的首次傳代應注意的問題？
細胞沒有生長到足以覆蓋瓶底壁的大部分表面以前，不要急于傳代；原代培養時細胞多為混雜生長，不同的細胞有不同的消化時間，因此要根據需要注意觀察及時處理，并根據不同細胞對胰蛋白酶的耐受時間而分離和純化所需要的細胞；
吹打細胞時動作要輕巧盡可能減少對細胞的損傷；首次傳代時細胞接種數量要多一些，使細胞能盡快適應新環境而利于細胞生存和增值；隨消化分離而脫落的組織塊也可一并傳入新的培養瓶。
20.使用胰蛋白酶時加入EDTA的目的？應如何處理？
EDTA作用較胰蛋白酶緩和，主要作用在于能從組織生存環境中吸取Ca2+、Mg2+，這些離子是維持組織完整的重要因素。但EDTA單獨使用不能使細胞完全分散，因而常與胰蛋白酶按不同比例混合使用，效果較好。常用比例為1：1或者2份EDTA：1份胰蛋白酶。EDTA的工作液濃度為0.02%，用不含Ca2+、Mg2+的BSS配置。如果使用EDTA，在終止消化前，需用緩沖液將消化液清除后才能加培養液。第一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中，保存于 –20 ℃，避免反復冷凍解凍造成胰蛋白酶的活性降低，并可減少污染的機會。
21.欲將一般動物細胞離心下來，其離心速率應為多少轉速？
欲回收動物細胞，其離心速率一般為800~1000 rpm，5~10 分鐘，過高的轉速，將造成細胞死亡。
22.細胞的接種密度為何？
依照細胞株基本數據上的接種密度或稀釋分盤的比例接種即可。細胞數太少或稀釋的太多亦是造成細胞無法生長的重要原因之一。
23.細胞交叉污染的可能原因？
多種細胞系進行維持傳代操作時，各細胞系所需的器材和溶液沒有嚴格分開，往往會使一種細胞被另一種細胞污染。
細胞凍存
24.冷凍培養基為什么要加DMSO？
因為細胞在不加任何保護劑的情況下直接凍存時，細胞內外的水分都會很快形成冰晶，冰晶的形成將造成細胞損傷，還可引起細胞的的死亡。目前多采用甘油和DMSO做保護劑。這兩種細胞無明顯毒性，分子量小，溶解度大，易穿透細胞，可以使冰點下降，提高包膜對水的通透性。
25.DMSO 的等級和無菌過濾的方式為何？
冷凍保存使用的 DMSO 等級，必須為 Tissue culture grade 的 DMSO，其本身即為無菌狀況，第一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中，保存于 4 ℃，避免反復冷凍解凍造成 DMSO 的裂解而釋出有害物質，并可減少污染的機會。若要過濾 DMSO，則須使用耐 DMSO 的 Nylon 材質濾膜。
26.欲冷凍保存時，細胞冷凍管內應有多少細胞濃度？
冷凍管內細胞數目一般為 1x106 cells/ml vial，融合瘤細胞則以 5x106 cells/ml vial 為宜。
27.冷凍保存細胞的方法？
冷凍保存方法一：冷凍管置于 4 ℃ 30~60 分鐘 →-20 ℃ 30 分鐘 → -80 ℃ 16~18 小時（或隔夜） → 液氮槽 vapor phase 長期儲存。
冷凍保存方法二：冷凍管置于已設定程序的可程序降溫機中每分鐘降 1~3 ℃ 至 –80 ℃ 以下， 再放入液氮槽 vapor phase 長期儲存。–20 ℃ 不可超過 1 小時，以防止冰晶過大，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入 –80 ℃ 冰箱中，存活率稍微降低一些。
28.細胞凍存太多會不會浪費？
每一種細胞系都應有充足的凍存儲備，防止由于細胞污染等因素造成的細胞系的絕種，而且每一批次培養的細胞狀態都不同，應該挑選幾個狀態較好的批次凍存保種。另外二倍體細胞等有限細胞系如果暫時不用最好凍存以免傳代太多，造成細胞衰老或者發生改變
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