單細胞測序技術的發展史
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發表時間：2024-11-13
2013年，單細胞測序技術被Nature Methods雜志評選為年度技術。2019年，單細胞多組學技術再次被 Nature Methods雜志評選為年度技術。進一步說明單細胞測序未來在基礎科研乃至醫學、農學等各個應用研究領域具有無限的潛力，將是未來科學發展的重要方向。我們一起來回顧一下單細胞測序技術發展史。
01
第一代測序技術
●時間：1970
●方法：基于DNA序列的測定方法，如引物延伸測序。
●特點：測序精度接近100%，但成本高、通量低。
●代表技術：Sanger測序法。
02
第二代測序技術
●時間：2000
●方法：高通量測序，可一次性測定數十萬至數百萬個DNA分子。
●特點：降低了測序成本，提高了通量，但仍然依賴于電泳分離技術。
●代表技術：
Illumina平臺：如Hiseq和Novaseq。
Solexa平臺：如Solexa Sequencing Platform。
03
第三代測序技術
●時間：2010
●方法：單細胞測序技術，包括邊合成邊測序（SBS）和納米孔測序技術。
●特點：解決了讀長短的問題，能夠直接對RNA和核酸修飾進行檢測。
●代表技術：
PacBio平臺：如SMRT技術。
Nanopore平臺：如Nanopore Technologies的MinION。
PART 01
plate-based SMART-seq
先用使用流式細胞儀或顯微操作進行細胞分選，裂解細胞，用SMART技術建立庫（使用Oligo(dT) primer對帶有polyA尾的RNA進行逆轉錄，所使用的MMLV酶在5'末端加C后，會繼續反過來合成DNA的另一條鏈（模板置換），由此形成雙鏈cDNA；在兩端加上PCR引物后，進行PCR擴增。
PART 02
DNA建庫方法
用酶將cNDA打碎成小片段，添加接頭用于后續測序，PCR擴增，完成建庫。
PART 03
Dropseq
DropSeq基于液滴微流控技術，首先，將細胞懸浮液與帶有分子條形碼的微珠懸浮液泵至微流控芯片，匯聚并形成層流，之后再與油相匯聚，形成單分散的微滴，將每個細胞與一個微珠一同包裹于同一微滴中，隨后完成RNA雜交并裂解微滴，釋放mRNA雜交物，完成逆轉錄，最后，以PCR方式完成核酸擴增，并進行測序分析。但該方法有個缺點，不能保證每個液滴中都有且僅有一個單細胞和一個磁珠。
PART 04
10X Genomics
這項技術整合了之前的技術，并做了改進。通過10×genomics儀器將單個細胞與單個凝膠微珠通過油相混在一起，形成油包水的小微滴，接下來把細胞膜破掉，讓細胞當中的mRNA游離出來。游離出來的mRNA與小液滴中的水相混合，和逆轉錄酶、結合在凝膠微珠上的核酸引物、以及dNTP底物相接觸，進行逆轉錄反應。mRNA與凝膠微珠上帶barcode的DNA分子相結合，在逆轉錄酶的作用下，逆轉錄出cDNA來。barcode的作用是方便后續測序時辨認樣本來源。
PART 05
微 孔 法
BD Rhapsody?平臺采用微孔捕獲技術，其擴增和測序部分與10X Genomics一樣，主要區別在于主要在于捕獲單細胞。其捕獲應用到蜂巢板，將細胞懸液平鋪在只能容納一個細胞的蜂窩里，蜂窩里有磁珠。隨后，Beads 同樣由注入孔注入，即可在單個反應孔中捕獲其中的細胞。其Beads上的序列結構也與10X Genomics 相似。
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