一篇文章讓你搞懂，RNA逆轉錄原理
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發表時間：2024-11-14
為了研究RNA的功能，通常需要通過逆轉錄過程將RNA轉化為更穩定的互補DNA（cDNA）。之后cDNA可通過分子克隆、PCR和測序等技術做進一步的研究。因此，逆轉錄過程是許多RNA實驗研究流程的關鍵步驟。
逆轉錄——reverse transcription，是以RNA為模板合成DNA的過程，合成的DNA稱為cDNA。逆轉錄過程遺傳信息的流動方向(RNA到DNA)，與轉錄過程(DNA到RNA)的方向相反，故稱為逆轉錄。
分子生物學最初的中心法則認為，DNA轉錄成RNA，然后再由RNA翻譯成蛋白質。但在上世紀70年代，隨著兩支科研團隊（分別為威斯康星大學的Howard Temin領導的團隊和麻省理工大學David Baltimore領導的團隊）各地獨立發現了與RNA病毒（逆轉錄酶病毒）復制相關的新酶，這一理論遇到了挑戰 。這些酶可以將病毒RNA基因組轉換成互補DNA (cDNA)分子，隨后即可整合到宿主的基因組中。這些酶為RNA依賴性DNA聚合酶，又稱逆轉錄酶。因為它們與核心理論的DNA到RNA流程不同，而是由RNA模板轉錄成cDNA分子。1975年，Temin 和 Baltimore憑借在發現逆轉錄酶方面的創舉，獲得諾貝爾生理學或醫學獎（與Renato Dulbecco共同獲得，后者憑借在誘導腫瘤病毒方面的成果獲獎）。
RNA逆轉錄原理主要涉及以下幾個關鍵步驟和概念：
01
逆轉錄的定義
RNA逆轉錄是將RNA轉化為互補DNA（cDNA）的過程。這一過程是許多RNA實驗研究的關鍵步驟，因為它允許通過分子克隆、PCR和測序等技術進一步分析cDNA。
02
逆轉錄酶
逆轉錄酶是一種特定的酶，能夠以RNA為模板合成cDNA。這種酶存在于一些RNA病毒中，如某些逆轉錄病毒。這些病毒的RNA不進行自我復制，而是通過逆轉錄酶將RNA轉化為DNA，進而整合到宿主細胞的DNA中。
03
實驗步驟
在實驗中，首先從細胞、組織、血液或植物等樣本中提取RNA。然后，通過特定的化學處理（如使用Trizol）來穩定RNA并防止其降解。接著，通過加入反轉錄酶和必要的反應條件（如溫度、pH值和鹽濃度），在逆轉錄酶的作用下合成cDNA。
04
注意事項
在逆轉錄過程中，需要注意基因組DNA的去除，以避免污染反轉錄結果。通常，這一過程會在RNA分離過程中加入DNase I，并在RT-PCR前徹底去除，以確保單鏈DNA（如引物和cDNA）的穩定性。
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