干貨分享 | get這些常規細胞實驗，高分文章穩了（上）
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發表時間：2024-11-14
干貨分享 | get這些常規細胞實驗，高分文章穩了（上）
細胞實驗可謂是最基礎也是最重要的實驗體系之一，我們可以通過細胞實驗產生的數據制作基礎疾病模型、了解藥物對細胞的影響、檢測信號通路……
細胞的實驗操作就像賽跑，你比別人跑的快，就比別人多發幾篇SCI…掌握這些常規細胞實驗，研究課題也會進展得更加順利哦~
細胞增殖實驗
細胞增殖與細胞凋亡、細胞周期等是腫瘤研究的重要表型，是分子生物學和藥理學研究解決的問題之一。通過在細胞中過表達或干擾某個基因研究基因對細胞增殖能力的影響，進一步研究基因的功能，或對細胞進行藥物處理，研究藥物對增殖的影響。
1. MTT法：是一種檢測細胞存活和生長的方法。該方法已廣泛用于生物活性因子的活性檢測、抗腫瘤藥物篩選、細胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等。它的特點是靈敏度高、經濟、快捷。
原理：活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚（Formazan）并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細胞中的甲瓚，用酶聯免疫檢測儀在490nm波長處測定其吸光度值，可間接反映活細胞數量。在一定細胞數范圍內，MTT結晶形成的量與細胞數成正比。
2. CCK-8法:可用于簡便而準確的細胞增殖和毒性分析，常用于藥物篩選、細胞增殖測定、細胞毒性測定、腫瘤藥敏試驗。
原理：該試劑中含有WST-8【化學名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被細胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產物（Formazan dye）。生成的甲瓚物的數量與活細胞的數量成正比。因此可利用這一特性直接進行細胞增殖和毒性分析。
3. Brdu: 即5-Bromo-2'-Deoxyuridine,中文全名5-溴脫氧尿嘧啶核苷，為胸腺嘧啶的衍生物，可代替胸腺嘧啶在DNA合成期，S期活體注射或細胞培養加入。而后利用抗Brdu單克隆抗體ICC染色顯示增殖細胞。同時結合其它細胞標記物雙重染色可判斷增殖細胞的種類，增殖速度，對研究細胞動力學有重要意義。
但由于抗體分子量大，難于摻入并被有效檢測。因此BrdU檢測需采用DNA酶或HCl或加熱使DNA變性。這些處理方法會破壞抗原識別位點，此外許多細胞周期分析的染料都需要dsDNA。這種處理方法也使得同一樣本無法同時進行細胞周期分析。對于植物細胞等有細胞壁的分析。采用抗體檢測還需要消化細胞壁，細胞壁消化酶常含有一些雜質，會導致檢測的可靠性降低，同時BrdU檢測則需要進行長時間的孵育——幾個小時甚至過夜。
4. EDU: 即5-Ethynyl-2’- deoxyuridine, 是一種胸腺嘧啶核苷類似物，能夠在細胞增殖時期代替胸腺嘧啶（T）滲入正在復制的DNA分子中。通過基于EdU與Apollo熒光染料的特異性反應快速檢測細胞DNA復制活性，適用于細胞增殖、細胞分化、生長與發育、DNA修復、病毒復制、細胞標記示蹤等方面的研究，尤其適合進行siRNA、miRNA、小分子化合物及其他藥物的篩選實驗。
細胞凋亡
細胞凋亡是腫瘤和發育研究的重點，同時也是藥理學研究的熱點。細胞凋亡是指細胞在一定的生理或病理條件下，遵循自身的程序，自主結束其生命的過程。它是一個主動的，高度有序的，基因控制的，一系列酶參與的過程。
細胞凋亡的過程大致可分為以下幾個階段：接受凋亡信號→凋亡調控分子間的相互作用→蛋白水解酶的活化（Caspase）→進入連續反應過程。
ANNEXIN V-PI法: 在正常細胞中，磷脂酰絲氨酸（PS）只分布在細胞膜脂質雙層的內側，而在細胞凋亡早期，細胞膜中的磷脂酰絲氨酸（PS）由脂膜內側翻向外側。Annexin?V是一種分子量為35~36kD的Ca2+依賴性磷脂結合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，故可通過細胞外側暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結合。因此Annexin?V被作為檢測細胞早期凋亡的靈敏指標之一。
將Annexin?V進行熒光素（EGFP、FITC）標記，以標記了的Annexin?V作為熒光探針，利用熒光顯微鏡或流式細胞儀可檢測細胞凋亡的發生。碘化丙啶（Propidium?Iodide,?PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但對凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI能夠透過細胞膜而使細胞核染紅。因此將Annexin?V與PI匹配使用，就可以將處于不同凋亡時期的細胞區分開來。
細胞膜片鉗技術
膜片鉗技術被稱為研究離子通道的“金標準”。是研究離子通道的最重要的技術。目前膜片鉗技術已從常規膜片鉗技術（Conventional patch clamp technique）發展到全自動膜片鉗技術（Automated patch clamp technique）
原理：膜片鉗技術是用微玻管電極（膜片電極或膜片吸管）接觸細胞膜，以千兆歐姆以上的阻抗使之封接，使與電極尖開口處相接的細胞膜的小區域（膜片）與其周圍在電學上分隔，在此基礎上固定點位，對此膜片上的離子通道的離子電流（pA級）進行監測記錄的方法。
用場效應管運算放大器構成的I-V轉換器是測量回路的核心部分。在場效應管運算放大器的正負輸入端子為等電位，向正輸入端子施加指令電位時，由于短路負端子以及膜片都可等電位地達到鉗制的目的，當膜片微電極尖端與默片之間形成10GΩ以上封接時，其間的分流電流達到最小，橫跨膜片的電流可100%作為來自膜片電極的記錄電流（lp）而被測量出來。
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CCK8/MTT、原代細胞分離、流式細胞實驗、細胞劃痕、侵襲、遷移、EDU染色、轉染、穩定株
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HE染色、免疫組學、電鏡
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7
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基因組、轉錄調控、蛋白組、代謝組、微生物多樣性、宏基因組、生信分析
8
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