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干貨分享 | get這些常規(guī)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，高分文章穩(wěn)了（下）

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干貨分享 | get這些常規(guī)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，高分文章穩(wěn)了（下）

前幾期帶大家了解過一些常規(guī)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)【干貨分享 | get這些常規(guī)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，高分文章穩(wěn)了（上）】，相信對(duì)大家課題研究方面還是有一些幫助的，今天再給大家整理一波，一起來看看吧~

細(xì)胞遷移和侵襲

在腫瘤發(fā)展過程中，細(xì)胞進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)的能力是重要的研究對(duì)象。相關(guān)的信號(hào)通路主要可以分為控制細(xì)胞黏附和控制細(xì)胞骨架。細(xì)胞的遷移與侵襲主要與細(xì)胞骨架和黏附相關(guān)。腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移能力的改變通常采用Transwell進(jìn)行檢測(cè)。細(xì)胞劃痕也是測(cè)定腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)特性的方法，由于無法區(qū)別正常增殖和遷移細(xì)胞，應(yīng)用有局限性。

1.Transwell實(shí)驗(yàn)

Transwell小室底層的一張有通透性的膜（一般為聚碳酸酯膜），將其放置于孔板中，小室內(nèi)稱上室，培養(yǎng)板內(nèi)稱下室。由于聚碳酸酯膜有通透性，下層培養(yǎng)液中的成分可以影響到上室內(nèi)的細(xì)胞。應(yīng)用Transwell可研究下層培養(yǎng)液中的成分對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)等的影響。

腫瘤遷移實(shí)驗(yàn)：研究腫瘤細(xì)胞的遷移能力或特定情況下腫瘤細(xì)胞的遷移能力。常用8.0、12.0μm膜，上室種腫瘤細(xì)胞，下室加入FBS或某些特定的趨化因子，腫瘤細(xì)胞會(huì)向營(yíng)養(yǎng)成分高的下室跑，計(jì)數(shù)進(jìn)入下室的細(xì)胞量可反映腫瘤細(xì)胞的遷移能力。

腫瘤侵襲實(shí)驗(yàn)：研究腫瘤細(xì)胞的侵襲能力或特定情況下腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。在聚碳酸酯膜上涂上一層基質(zhì)膠，模仿細(xì)胞外基質(zhì)，上室種腫瘤細(xì)胞，下室加入FBS或某些特定的趨化因子，細(xì)胞要把基質(zhì)消化后才可以從上室遷移到下室，計(jì)數(shù)進(jìn)入下室的細(xì)胞量測(cè)定細(xì)胞的侵襲能力。　

?目的：研究目的基因過表達(dá)/干擾對(duì)細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力的影響

?材料：正常細(xì)胞、對(duì)照慢病毒、過表達(dá)基因慢病毒

?步驟：細(xì)胞復(fù)蘇——Transwell鋪板——細(xì)胞培養(yǎng)及染色——拍照

?結(jié)果：

2. 劃痕實(shí)驗(yàn)：

劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移的原理：在體外培養(yǎng)皿或平板培養(yǎng)的單層貼壁細(xì)胞上，用微量槍頭或其它硬物在細(xì)胞生長(zhǎng)的中央?yún)^(qū)域劃線，去除中央部分的細(xì)胞，然后繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞至實(shí)驗(yàn)設(shè)定的時(shí)間，取出細(xì)胞培養(yǎng)板，在顯微鏡下觀察并拍照記錄特定位置細(xì)胞的生長(zhǎng)遷移能力。

實(shí)驗(yàn)通常需設(shè)定正常對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組,實(shí)驗(yàn)組是加了某種處理因素或藥物、外源性基因等的組別，通過不同分組之間的細(xì)胞對(duì)于劃痕區(qū)的修復(fù)能力，可以判斷各組細(xì)胞的遷移與修復(fù)能力。

細(xì)胞周期檢測(cè)

細(xì)胞周期（cell cycle）是指細(xì)胞從一次分裂完成開始到下一次分裂結(jié)束所經(jīng)歷的全過程，分為間期與分裂期兩個(gè)階段。細(xì)胞周期反應(yīng)了細(xì)胞增殖速度，單個(gè)細(xì)胞的周期測(cè)定可采用縮時(shí)攝影的方法，但它不能代表細(xì)胞群體的周期，故現(xiàn)多采用其他方法測(cè)群體周期。

原理：細(xì)胞周期各時(shí)相的DNA含量不同，通常正常細(xì)胞的 G0/G1期具有二倍體細(xì)胞的DNA 含量(2N)，而G2/M期具有四倍體細(xì)胞的DNA含量(4N)，而S期的DNA含量介于二倍體和四倍體之間。PI 即碘化丙錠，可以與細(xì)胞內(nèi)DNA 和RNA 結(jié)合，采用RNA酶將RNA消化后，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)到的與DNA 結(jié)合的PI 的熒光強(qiáng)度直接反映了細(xì)胞內(nèi)DNA含量的多少。

因此，通過流式細(xì)胞術(shù)PI染色法對(duì)細(xì)胞內(nèi)DNA含量進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，可以將細(xì)胞周期各時(shí)相區(qū)分為 G0/G1期，S 期和G2/M期，并可通過特殊軟件計(jì)算各時(shí)相的百分率。

?目的：通過慢病毒感染獲得基因過表達(dá)的細(xì)胞株，利用PI染色法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞周期的變化。從而研究目的基因?qū)?xì)胞周期的影響。

?材料：目的細(xì)胞、病毒

?步驟：細(xì)胞準(zhǔn)備——樣品收集——上機(jī)檢測(cè)——數(shù)據(jù)分析

?結(jié)果：

細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)原理：?jiǎn)蝹€(gè)細(xì)胞在體外增殖6代以上（時(shí)間約1周以上），其后代所形成的細(xì)胞群體，稱為集落或克隆。每個(gè)克隆含有50個(gè)以上的細(xì)胞，大小在0.3 - 1.0mm之間。

細(xì)胞接種存活率只表示接種細(xì)胞后貼壁的細(xì)胞數(shù)，但貼壁后的細(xì)胞不一定每個(gè)都能增殖并形成克隆。只有同時(shí)具有貼壁和增殖活力的細(xì)胞才會(huì)形成克隆。克隆形成率反映細(xì)胞的獨(dú)立生存能力的強(qiáng)弱，用于評(píng)價(jià)細(xì)胞群體依賴性和增殖能力。

由于細(xì)胞生物學(xué)性狀不同，細(xì)胞克隆形成率差別也很大，一般初代培養(yǎng)細(xì)胞克隆形成率弱，傳代細(xì)胞系強(qiáng)；二倍體細(xì)胞克隆形成率弱，轉(zhuǎn)化細(xì)胞系強(qiáng)；正常細(xì)胞克隆形成率弱，腫瘤細(xì)胞強(qiáng)。克隆形成率與接種密度有一定關(guān)系，做克隆形成率測(cè)定時(shí)，接種細(xì)胞一定要分散成單細(xì)胞懸液，直接接種在培養(yǎng)皿中，持續(xù)一周以上，隨時(shí)檢查，到細(xì)胞形成克隆時(shí)終止培養(yǎng)。

?目的：通過目的基因過表達(dá)/干擾細(xì)胞組、空細(xì)胞組與陰性對(duì)照組(空病毒)克隆形成數(shù)量的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，研究基因?qū)?xì)胞群體依賴性和增殖能力的影響。

?材料：病毒和細(xì)胞株

?步驟：鋪板——細(xì)胞培養(yǎng)——觀察克隆，染色，計(jì)算克隆形成率

?結(jié)果：

細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)原理：細(xì)胞黏附性是維持組織結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的基本條件，也是細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和發(fā)揮功能的調(diào)節(jié)因素，并且對(duì)細(xì)胞的增殖、分化有重要影響。通常可分為兩類，即細(xì)胞與細(xì)胞黏附和細(xì)胞與基質(zhì)黏附。

機(jī)體內(nèi)許多細(xì)胞，如上皮細(xì)胞，需要牢固地定在某處發(fā)揮功能；另一些細(xì)胞，如白細(xì)胞，活躍運(yùn)動(dòng)，就需要不斷調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附。細(xì)胞黏附性的改變?cè)谀[瘤轉(zhuǎn)移過程中也發(fā)揮著重要作用。惡性腫瘤具有從原發(fā)瘤分離及在體內(nèi)擴(kuò)散的能力，提示這些細(xì)胞在相互識(shí)別及黏附機(jī)制方面發(fā)生了改變。

實(shí)驗(yàn)方法：

1、將4.5×105個(gè)Hep3B細(xì)胞/孔傳代于無菌6孔培養(yǎng)板中。

2、培養(yǎng)24h后，用Lipofectamine?TM?2000將37LRP?siRNA轉(zhuǎn)染Hep3B細(xì)胞（兩個(gè)平行孔，Lipofectamine?TM?2000轉(zhuǎn)染具體操作見方法7），轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，48h后收集細(xì)胞。同時(shí)各有兩個(gè)平行孔的細(xì)胞進(jìn)行陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染及不行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染終濃度即siRNA終濃度為100nmol/L。?

3、培養(yǎng)48小時(shí)后收集細(xì)胞，用0.25%胰酶將貼壁培養(yǎng)細(xì)胞（約1×106個(gè)）從壁上消化下來并制成單細(xì)胞懸液。?

4、用無血清MEM培養(yǎng)基將Matrigel配制成10ug/250ul（1:300）的人工基底膜膠備用。

5、96孔板每孔中鋪Matrigel?2ug/50ul，放于超凈臺(tái)中風(fēng)干過夜。?

6、96孔板每孔加入適量無血清MEM細(xì)胞培養(yǎng)液(或PBS或生理鹽水)，放置60－90分鐘，洗去多余的膠；?

7、取轉(zhuǎn)染、陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染及不行轉(zhuǎn)染的Hep3B細(xì)胞以4×103/孔接種在鋪膠的96孔板中，設(shè)3個(gè)重復(fù)孔，放入37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)20min、40min、60min。?

8、在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)取出96孔板，吸出培養(yǎng)液，用PBS洗3遍，洗去未粘附細(xì)胞。

9、每孔加入100?ul甲醇，固定15min。?

10、每孔加入100?ul姬姆薩染液，染色15min，蒸餾水洗去染液。?

11、在200倍顯微鏡下計(jì)數(shù)粘附細(xì)胞數(shù)量（每孔在固定位置取8個(gè)視野）。

如有實(shí)驗(yàn)技術(shù)問題，可咨詢我們

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2000㎡生物實(shí)驗(yàn)室

主營(yíng)項(xiàng)目

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

動(dòng)物飼養(yǎng)、疾病造模、行為學(xué)檢測(cè)、心功能、無創(chuàng)血壓、血常規(guī)、全自動(dòng)生化檢測(cè)等

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

CCK8/MTT、原代細(xì)胞分離、流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕、侵襲、遷移、EDU染色、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定株

分子生物學(xué)

PCR檢測(cè)、熒光定量PCR、絕對(duì)定量PCR、端粒酶長(zhǎng)度、pull down、雙熒光素酶、SSR、SNP檢測(cè)等

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END

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