為什么你的流式實驗總做不好？盤點24個流式高頻問題
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發表時間：2025-06-27
這篇文章為大家總結了一系列流式實驗常見問題，看完絕對可以有效避坑（建議存入收藏夾備用）！
1. 無信號/熒光強度弱
補償問題
多色流式配色很關鍵，低表達的抗原可以用相同熒光素的高表達抗原代替，或者使用補償微球。
用于檢測的抗體不足
一定要做抗體滴定，按照說明書的要求加抗體。
無法接近細胞內靶標
確定好抗原的表達位置，選擇合適的染色方法和刺激方法。
細胞內染色 - 熒光染料結合分子太大
細胞內染色實驗應使用小分子量的熒光染料。
激光器未對齊
做實驗前一定要確保儀器沒有問題。流式細胞儀是流式的三大基本要素之一，要經常維護儀器，做質控，并清洗儀器。確保流式細胞儀上的激光器正確對齊，必要時通過運行液流檢查微珠來調整路線。如果激光器未正確對齊或發生偏移，則可能需要考慮維修機器。
靶蛋白不存在/低水平表達
確保您正在分析的組織/細胞類型能表達靶蛋白，并且靶蛋白的量足以被檢出。
細胞因子類marker
正常的淋巴細胞處于未激活狀態，不會分泌細胞因子。因此要選擇合適的方法激活淋巴細胞，使其釋放細胞因子，達到檢測水平。同時要加蛋白轉運抑制劑使其留在胞內，然后固定破膜，染相應抗體。細胞刺激劑、蛋白轉運抑制劑以及固定破膜的試劑的選擇都會影響染色結果。
熒光淬滅
抗體可能存放太久或沒有避光。還要考慮固定試劑的問題。
一抗和二抗不匹配
使用的二抗應與一抗來源種屬不同（例如，一抗為兔源，則應該使用抗兔源二抗）。為了解決種屬交叉反應性的問題，您可以使用經流式細胞術驗證的直接偶聯一抗，或者使用偶聯物試劑盒，在您選擇的抗體中加入合適的熒光染料。
2.熒光強度高
抗體濃度過高
做抗體滴定。
過量抗體被捕獲
胞內染色特有的問題。染色后，充分清洗。也有可能是破膜劑的問題，破膜不夠充分。
封閉不足
做Fc受體阻斷是一個特別好的流式習慣，但不是所有的細胞都需要做封閉，做封閉是為了減少非特異性結合。
3. 背景高/陽性細胞百分比高
增益設置過高/補償過低
使用陽性對照正確設置流式細胞儀，使用補償減少小顆粒背景信號并減少增益，以降低信號。
抗體過量
抗體滴定。清洗充分。
4. 在應該只有1個細胞群時觀察到2個或以上
表達目的marker的細胞群不止1個
做實驗前要確定好目的細胞的目的marker。
出現細胞雙峰
細胞雙峰顯示為第二大細胞群，其熒光強度大約是單細胞熒光強度的兩倍。制樣和上機的過程要確保是單細胞懸液，并且過濾掉大的組織團塊。
5. 側向散射背景偏高（來自小顆粒）
細胞裂解
制樣問題，保證細胞的活力，不能有太多碎片。注意離心條件和渦旋力度。
細菌污染
確保樣本不受污染。細菌會自動發出較弱的熒光，導致高事件率。
去死活
樣本制備不可避免的會出現細胞死亡或壞死，特別是實體組織制備的單細胞懸液，一定要染死活，不染自發熒光會很高，干擾實驗結果。
6. 其他
細胞量
正常1×106個細胞/100 μL體系中染色。表達量高的膜表面分子可以體系減半抗體減半。固定破膜的過程中，會損失掉一些細胞。因此，表達量低、胞內、核內分子可以加大細胞量，相應體積的抗體也可以對應細胞量多加，一定要做預實驗和抗體滴定，摸索最佳染色效果。
電壓
裸細胞調完FSC、SSC的電壓，記得調熒光通道的電壓。
對照
一定要設置好對照組，補償對照、陰性對照、陽性對照（生物學對照）、同型對照、FMO對照。
細胞聚集，阻塞管道
制樣的過程中一定要確保是單細胞懸液，制樣和上機的時候過濾掉組織團塊。
固定
某些熒光素對多聚甲醛敏感，要注意，可以選擇成品、溫和的固定液。如果固定過夜，上機前要清洗掉多聚甲醛再上機。
最后提醒大家：一定要做預實驗和抗體滴定，把所有的對照都設置好，預實驗盡可能排除掉所有可能出現的問題，穩定條件，甚至可以在流式細胞儀上設好panel，再上大規模的實驗！
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