【科研干貨】各類體外細胞實驗合集詳解！
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發表時間：2025-06-27
體外細胞實驗是我們開展課題研究及進行生物醫藥醫學研究非常重要的途徑。
今天整理了多種體外細胞實驗的干貨共大家學習和參考：MPC5足細胞缺氧模型、脊索樣細胞誘導分化成髓核樣細胞、人誘導多功能干細胞(hiPSC)誘導分化成脊索樣細胞、大鼠脂肪間充質干細胞成脂誘導模型、3T3-L1細胞成脂誘導模型、乳鼠二型肺泡上皮細胞(AECII)分離提取。
LPS誘導細胞炎癥模型
1. 實驗背景
脂多糖(Lipopolysaccharide)(英文簡寫LPS)是革蘭氏陰性細菌細胞壁外壁的組成成分，是由脂質和多糖構成的物質(糖脂質)。脂多糖由三部分組成:類脂A、核心多糖、O-抗原。LPS中的類脂A部分作為脂質雙分子層外層的組成部分進入到脂質層中，糖鏈部分暴露在細胞外面，然后以這種形式存在于革蘭氏陰性細菌的細胞表面。在LPS的生理活性表現中被認為起到最重要作用的是類脂A部分，類脂A可以單獨體現其生理作用 。LPS很難從細胞壁脫落，當細菌死亡等時它會通過溶解、破壞細胞來脫落，并通過作用于動物細胞等而發揮其毒性。由于這種性質，它不是細菌分泌到體外的毒素(外毒素)，而是不被分泌的"存在于細菌體內的毒素"，所以又被稱為內毒素。
內毒素模型是將純化的LPS直接注射人動物體內構建的，由于其致病因素單一、能夠排除其他影響因素，而成為研究細菌感染單一成分在感染引起的炎癥反應中的發病機制的理想模型1。LPS是革蘭氏陰性菌細胞壁最外層的一層較厚(8~10nm)的類脂多糖物質，因其在免疫調節方面的特性而成為醫學研究的興趣點。
2. 實驗材料
① 實驗細胞：RWPE-1細胞。
② 器械：超凈工作臺、CO2培養箱、生物倒置顯微鏡、臺式低速離心機
③ 試劑：0.25% 胰蛋白酶、雙抗、胎牛血清、PBS、RWPE-1細胞專用培養基、
3. 實驗操作
① 取LPS粉末溶于無菌水使其母液濃度為5mg/ml，0.22um過濾器過濾；
② 用細胞專用培養基稀釋LPS母液；
③ 細胞鋪板24h后，棄上清加入配制好的LPS溶液；
④ 37℃ 5%CO2培養箱繼續孵育24h；
⑤ 檢測相應炎癥指標。
4. 評價方法
① ELISA檢測細胞炎癥因子表達(IL-1、IL-6、IL-18、TNF-α等)；
② 試劑盒檢測ROS、LDH、SOD、MDA等；
③ 流式/免疫熒光檢測ROS、JC-1等；
④ PCR/WB檢測炎癥因子基因和蛋白水平的表達等。
5. 經驗總結
① LPS可溶于DMSO，也可溶于水，為了減少溶劑對細胞的影響，可選擇水去溶解LPS，最大溶解度為5mg/ml；
② LPS誘導細胞炎癥反應，一定濃度誘導細胞不一定會出現細胞死亡的情況，因此不宜選用CCK8法去選擇LPS造模濃度，可選擇檢測多個炎癥因子去篩選濃度；
③ 不同廠家品牌的LPS貨號不同引起的炎癥反應不一定相同，還需客戶自己選擇。
MPC5足細胞缺氧模型
1. 實驗背景
正常情況下，細胞體外培養需5%CO2與95%空氣環境，然而，降低培養環境的氧分壓或使細胞用氧障礙可以造成缺氧狀態，目前常用的缺氧方法有物理性缺氧法和化學性缺氧法。
① 物理性缺氧法：通過降低培養環境的氧分壓造成細胞缺氧性損傷，類似于體內發生的低張性缺氧。
② 化學性缺氧法：在培養基中加入化學物質，造成細胞用氧障礙或使培養基內的氧氣耗盡，如在培養基內加人氰化物、連二亞硫酸鈉等。化學缺氧模型制備簡單，但由于添加的物質可能會改變培養基的化學成分，且添加劑本身對細胞有損傷作用，增加了實驗的混雜因素，需慎重選用。
③ 聯合缺氧法：2種或2種以上方法聯合使用可使細胞缺氧更為明顯。例如：在培養基中添加連二亞硫酸鈉，然后，將細胞放入95%N2+5%CO2密閉容器中，連二亞硫酸鈉已使培養基內氧氣耗盡，再置入無氧外環境即可造成穩定的細胞缺氧。
2. 實驗材料
① 實驗細胞：MPC5細胞
② 器械：超凈工作臺、CO2培養箱、生物倒置顯微鏡、臺式低速離心機、酶標儀、三氣培養箱
③ 試劑：0.25% 胰蛋白酶、雙抗、胎牛血清、PBS、DMEM培養基、CCK8
3. 實驗操作
① 細胞鋪兩塊96孔板，
② 37℃，5%CO2箱中孵育24h后，細胞換液；
③ 將其中一塊96孔板放置在設置缺氧的三氣培養箱中培養；
④ 培養至低氧細胞出現明顯損傷后分別取出96孔板；
⑤ 吸去培養基，向每孔中加入100μL CCK-8混合液；37℃，5%CO2箱中孵育1-2h；
⑥ 酶標儀測定在450 nm處的吸光度。
4.評價方法
① CCK8檢測；
② 顯微鏡下觀察細胞形態。
5. 經驗總結
① 細胞經過常氧與低氧處理時，要控制好兩塊培養板內的細胞密度，必須同時鋪板，保持細胞密度一致。
② 細胞鋪板后需要在常氧下穩定培養24h，使其細胞能正常貼壁生長，24h后需同時更換新鮮培養基后在進行常氧與缺氧分別處理。
③ 低氧模型時間長短需要實時觀察細胞是否有損傷，不同的細胞缺氧模型的氧濃度和細胞損傷時間還需以具體實驗為準。
脊索樣細胞誘導分化成髓核樣細胞
1. 實驗背景
椎間盤再生研究中，脊索細胞獨特的生理功能受到關注。成人髓核內脊索細凋亡與髓核內蛋白多糖含量降低、膠原含量增加、水含量丟失相關.脊索細胞分泌的可溶性因子具有引導終板軟骨細胞向髓核遷移，調節髓核細胞蛋白多糖合成的作用。脊索細胞可促進髓核軟骨樣細胞增殖和表型維持，在維持髓核內細胞數量及細胞外基質含量中起著重要作用。脊索細胞獨特的生理功能，在組織工程修復退變椎間盤研究中展現出廣闊的應用前景。
2. 實驗材料
① 實驗細胞：脊索樣細胞。
② 器械：超凈工作臺、CO2培養箱、生物倒置顯微鏡、臺式低速離心機。
③ 試劑：0.25% 胰蛋白酶、雙抗、hiPSC細胞專用培養基、ITS、NEAA、抗壞血酸、L-脯氨酸、地塞米松及TGF-β3。
3. 實驗操作
采用含有1%的ITS、1%的NEAA、1%的青鏈霉素、50ug/ml抗壞血酸、40ug/ml的L-脯氨酸、10nM的地塞米松及10ng/ml的TGF-β3的DMEM-HG培養基進行誘導，細胞誘導15天以上，實時觀察拍照。
4. 評價方法
① 可測定空泡細胞；
② 流式細胞熒光分選空泡細胞的GD2/TIE2的表型；
③ 免疫熒光染色分析各組細胞中GD2（雙唾液酸神經節苷脂2）、TIE2（TEK受體酪氨酸激酶2）、II型膠原、aggrecan、T及NOTO的表達。
5. 經驗總結
① 細胞誘導過程中需每天更換誘導培養基，已滿足細胞營養需求，若細胞出現較多死亡，及時更換成正常細胞完全培養基進行過度。
② 細胞誘導周期較長，容易出現細胞扎堆情況，拍照時盡量選擇細胞單層生長的區域去拍照。
③ 誘導后期鏡下觀察出現大量空泡細胞，即可收集樣本驗證誘導是否成功。
人誘導多功能干細胞(hiPSC)
誘導分化成脊索樣細胞
1.實驗背景
誘導性多能干細胞（Induced pluripotent stem cells，iPSCs）技術是指通過導入特定的轉錄因子將終末分化的體細胞重編程為多能性干細胞。分化的細胞在特定條件下被逆轉后，恢復到全能性狀態，或者形成胚胎干細胞系，或者進一步發育成新個體的過程即為細胞重編程（Cell reprogramming）。分化是基因選擇性表達的結果，并沒有改變遺傳物質，而重編程在某種意義上就是分化的一個逆轉。
與經典的胚胎干細胞技術和體細胞核移植技術不同，iPSCs技術不使用胚胎細胞或卵細胞，因此沒有倫理學問題。此外，利用iPSCs技術可以用病人自己的體細胞制備專有的干細胞，從而大大降低了免疫排斥反應發生的可能性。iPSCs的岀現，在干細胞、表觀遺傳學以及生物醫學等研究領域都引起了強烈的反響，使人們對多能性的調控機制有了突破性的新認識，進一步拉近了干細胞和臨床疾病治療的距離。
iPSCs在細胞替代性治療以及發病機理的研究、新藥篩選以及神經系統疾病、心血管疾病等臨床疾病治療等方面具有巨大的潛在價值。
2. 實驗材料
① 實驗細胞：hiPSC細胞。
② 器械：超凈工作臺、CO2培養箱、生物倒置顯微鏡、臺式低速離心機。
③ 試劑：0.25% 胰蛋白酶、雙抗、hiPSC細胞專用培養基、ACTIVIN A、CHIR、NOGGIN、AGN193109、FGF2。
3. 實驗操作
① 取hiPSC細胞復蘇和擴培后測定細胞數量，
② 當細胞量密度大于5*105/cm2時，
③ 加入10ng/ml的ACTIVIN A，3uM的CHIR，50ng/ml的NOGGIN，10uM的AGN193109，及10ng/ml的FGF2處理細胞，
④ 培養到第5天左右，實時觀察細胞形態變化，
⑤ 收集爬片做免疫熒光驗證等。
4. 評價方法
可用IF或qPCR分析細胞NOTO、T及FOXA1、Chordin、FOXJ1、Noggin、及SHH的表達，來評價脊索樣細胞誘導分化成功。
5. 經驗總結
① 培養前一天，提前包被人多潛能干細胞鋪底工作液的培養皿/瓶，并加入適量復蘇完全培養基，置于5% CO2的37℃恒溫細胞培養箱中。細胞復蘇需使用復蘇專用培養基，可大大提高細胞的復蘇效率。復蘇過程中，轉移細胞、吹打混勻和重懸細胞時，吹打力度要輕柔，并盡量減少吹打次數，細胞接種后，即刻在顯微鏡下觀察細胞團塊的大小，4 ~ 10個細胞的團塊為最佳。如果吹打力度過大或次數過多，導致細胞分散成單細胞，細胞復蘇率將偏低。
② 細胞培養需每天更換新鮮完全培養基，以滿足細胞營養需求，誘導過程中也需每天換液。
大鼠脂肪間充質干細胞成脂誘導模型
1. 實驗背景
間質干細胞向成骨細胞的分化是理解骨形成機制的有力工具，它也被用于鑒別骨質疏松癥、骨修復和成骨不全等遺傳紊亂疾病。同其他組織器官一樣，骨組織也在不斷地進行著細胞代謝，稱為骨代謝。它可以大致分為骨形成和骨重塑兩個階段，前者在個體生長發育期起主要作用，后者則持續整個生命周期。
成骨分化是骨生成的關鍵步驟，即骨髓間充質干細胞經歷骨原細胞（osteoprogenitor cells）、成骨前體細胞（pre-osteoblasts）、成熟的骨細胞（osteoblasts）和終末階段的骨細胞（osteocytes）的一個復雜的過程，其中涉及到多種類型細胞間和細胞內的信號傳遞，如信號通路、轉錄因子、生長因子、MicroRNA 等，形成了一個完整的骨代謝調控負反饋環路。
2. 實驗材料
① 實驗細胞：大鼠脂肪間充質干細胞。
② 器械：超凈工作臺、CO2培養箱、生物倒置顯微鏡、臺式低速離心機。
③ 試劑：0.25% 胰蛋白酶、100x雙抗、大鼠脂肪間充質干細胞專用培養基、成骨誘導分化試劑盒，茜素紅S染色液。
3. 實驗操作
① 當大鼠脂肪間充質干細胞的融合度達到80-90%時，即可用0.25%胰酶進行消化。
② 將消化下來的細胞，根據細胞即時的生長速度估算，接種一定量的細胞（接種后第二天的匯合度能達到70-80%）于6孔板中，每孔加入2ml專用完全培養基培養。
③ 將細胞置于37℃，5%CO2的培養箱中培養。
④ 當細胞融合度達到70-80%（或＞80%）時，小心將上清吸走，加入2ml大鼠脂肪間充質干細胞成骨誘導分化培養基。
⑤ 每隔三天換用新鮮的大鼠脂肪間充質干細胞成骨誘導分化培養基。
⑥ 誘導2-4周后，視細胞的形態變化及生長狀況，使用茜素紅S染色液進行鑒定。
4. 評價方法
茜素紅S染色：茜素紅S是一種蒽醌類衍生物，能和多種金屬離子螯合生成穩定的橙紅色或深紅色的復合物，是一種良好的金屬指示劑，也可作為吸光度法測定金屬離子的顯色劑，還可作為酸堿指示劑，或用于極譜法測定金屬離子。在組織學和組織病理學中，由于茜素紅S可與碳酸鈣或磷酸鈣中的鈣鹽螯合形成橙紅色復合物，而常用于染色或定位組織中的鈣質沉積。
5. 經驗總結
① 大鼠脂肪間充質干細胞成骨誘導時，融合度盡量達到80%，或者更高，誘導時可能會使細胞有所損傷導致后期產生骨細胞量少，但融合度一定不能低于70%。
② 換誘導培養基的頻率大致保持在3天一次，如果期間細胞產生的排泄物導致培養基內雜質多便可以馬上換液，不可以過度延長換液時間，導致細胞死亡。
③ 為了減少誘導過程中細胞飄起、不貼壁，鋪板前可先鋪明膠包被細胞板底部，換液時盡量輕輕加入誘導培養基，不要將細胞吹起，導致細胞脫落。
3T3-L1細胞成脂誘導模型
1. 實驗背景
細胞生物學方面，前脂肪細胞是一類同時具有增殖及分化為成熟脂肪細胞能力的前體細胞，此種前體細胞在不同的生長因子、激素等的作用下,經歷有絲分裂克隆期、生長停滯期、進一步的克隆期 終末分化四個階段，細胞本身的成纖維狀態發生改變，通過胞質內甘油三酯聚集形成成熟脂肪細胞，這一過程，稱為“成脂分化”，該過程一直是肥胖研究領域的熱點。
為了能夠直觀地了解細胞分化內部脂質累積的過程，需要在體外建立數量可控，分化較為穩定的成熟脂肪細胞分化模型。3T3-L1細胞 (小鼠胚胎成纖維細胞)是通過克隆分離得到的3T3(swiss小白鼠)的連續亞株。當3T3-L1細胞從快速分裂到長滿且接觸抑制時，3T3-L1細胞在適當的誘導下前脂肪可向脂肪樣逆轉。
2. 實驗材料
① 實驗細胞：3T3-L1細胞。
② 器械：超凈工作臺、CO2培養箱、生物倒置顯微鏡、臺式低速離心機。
③ 試劑：0.25% 胰蛋白酶、雙抗、3T3-L1細胞專用培養基、成脂誘導分化試劑盒。
3. 實驗操作
① 加1ml 0.1%明膠到六孔板中，搖勻，使其能覆蓋各孔底面。
② 將鋪有0.1%明膠的六孔板放置在超凈臺或CO2培養箱至少30min。
③ 30min后吸去明膠即可用于接種細胞；
④ 將細胞接種于六孔板，37℃、5%CO2培養。
⑤ 當細胞匯合度達到100%時，小心地將孔內完全培養基吸走，向六孔板中加入2ml OriCell?小鼠細胞成脂誘導分化培養基A液。
⑥ 誘導3天后，吸去A液，加入成脂誘導分化培養基B液。
⑦ 維持1天后，換回A液進行誘導。
⑧ A液和B液交替使用。
⑨ 重復誘導和維持過程，直到出現足量、大小適宜的脂滴，即可油紅O染色。
4. 評價方法
油紅O脂肪染色法是指在日常病理診斷和科研工作中為了顯示組織或細胞內的脂肪常采用油紅O進行染色的方法，油紅O為脂溶性染料，在脂肪內能高度溶解，可特異性的使組織或細胞內甘油三酯等中性脂肪著色。可將油脂染成紅色，顯微鏡下觀察染色情況即可評估細胞的成脂性。
5. 經驗總結
① 油紅O染色后盡快拍照，或者用封口膜封裝后置于4℃，不要超過一周，油脂會相互融合，無法保持染色時的狀態。
② A液刺激脂滴形成，B液維持已形成的脂滴，并促進脂滴增大。通常情況下按照“A液3天，B液1天”的使用方法，也可根據細胞狀態靈活調整A液、B液的使用比例。
③ 為了減少誘導過程中細胞飄起、不貼壁，鋪板前先鋪明膠包被細胞板底部，誘導時間過長也有可能出現細胞層卷邊情況，若已有足量、大小合適的脂滴，即可染色收集。
乳鼠二型肺泡上皮細胞(AECII)分離提取
1. 細胞簡介
二型肺泡細胞(ATⅡ)又稱顆粒肺泡細胞，散在分布于ATⅠ肺泡細胞(ATⅠ)之間及其相鄰的肺泡間隔結合處。其體積較小，呈立方形，表面稍突向肺泡腔。細胞核大而圓，胞質染色較淺淡，胞質中常見空泡。數量較ATⅠ多，ATⅡ占肺泡上皮細胞總數的14%到16%，但僅覆蓋5℅的肺泡表面。二型肺泡細胞能分泌顆粒內容，在肺泡上皮表面形成表面活性物質，具有降低肺泡表面張力，穩定肺泡大小的重要作用。
2. 原代分離提取步驟
① 將乳鼠移入超凈臺，從胸部橫斷乳鼠，小心取出雙肺置于預冷的PBS液中，盡可能除凈殘留的氣管組織和結締組織等非肺組織，PBS液清洗2~3次，用鋒利眼科剪將肺組織剪為1mm3 左右大小的組織碎塊，用0.25%胰酶（含0.01% DnaseⅠ）溶液清洗1次，然后繼續用0.25%胰酶（含0.01% DnaseⅠ）溶液于37℃攪動消化10~20min。
② 用等量10%FBS的DMEM/F12（完全培養基）終止消化，200目篩網過濾后，1500r/min低溫離心５min，去上清，收集沉淀，0.1%Ⅰ型膠原酶 37℃，5% CO2 孵箱內消化10~20min。
終止消化仍用等量含10%FBS的DMEM/F12，1000r/min離心5min，收集細胞沉淀。
③ 將細胞懸液接種入培養瓶中，置37℃，5% CO2培養箱內孵育45min，此時貼壁的細胞多為成纖維細胞，懸在培養液中的細胞多數為AECⅡ、部分成纖維細胞及其他雜細胞。
④ 將培養液吸出接種于另一培養瓶中，同樣繼續37℃孵育40min，連續2~3次，最后吸出培養液，800r/min離 心5min，去上清，用含10%胎牛血清的DMEM/F12重懸細胞沉淀，按密度為4*105個細胞／cm2 接種于培養瓶中，37℃，5% CO2條件下培養24h后換液，去除未貼壁細胞繼續培養3~6d，倒置顯微鏡觀察細胞生長狀態和形態特征。培養48h細胞狀態良好，可進行進一步的后續實驗。
3. 乳鼠二型肺泡上皮細胞（AECⅡ）質量評價
① 臺盼藍染色法
活細胞計數：臺盼藍染色后顯微鏡下進行細胞計數，計算細胞存活率（活細胞數/細胞總數×100%）。
② AECⅡ形態特征觀察
體外原代培養的AECⅡ約18h已經貼壁生長。
培養24h，細胞伸展呈多邊形或立方形，聚集成島狀生長，細胞之間連接緊密，細胞胞質豐富，內含大量反差明顯的細小顆粒（圖1）。
培養36~48h，細胞平展呈多邊形，逐漸融合，相互連接成細胞單層。培養大約72h后，細胞逐漸變得扁平，細胞內顆粒較前減少，有排空現象，胞質顏色變淡（圖2）。
③ 透射電鏡觀察
細胞消化后，離心，收集細胞沉淀。經戊二醛固定處理程序后，制成電鏡細胞標本，用電鏡觀察細胞特征性的超微結構，可見黑色顆粒狀特征性的板層體，細胞膜上有明顯的微絨毛。
④ 純度鑒定
經SP-C免疫熒光鑒定細胞純度。
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