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流式細胞術：當代最先進的細胞定量分析技術

瀏覽：177 發表時間：2025-07-01

流式細胞術 (Flow Cytometry, FCM) 是一種在液流中快速檢測細胞特性的技術，是當代最先進的細胞定量分析技術之一。它通過將單個細胞與特異性抗體結合，對細胞進行多參數定量分析，包括細胞表面標記、細胞內蛋白質表達、細胞周期、DNA含量等。流式細胞術具有高通量、高靈敏度、高特異性等優點，廣泛應用于免疫學、血液學、腫瘤學等領域。

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流式細胞術原理

一、分析型流式細胞儀檢測原理

將待測樣品制成單細胞懸液，在鞘液的包裹下進入流式細胞儀內的檢測區域，細胞在激光的照射下會發生散射和折射，產生的散射光信號和熒光信號由不同的通道接收。

其中前向角散射光(FSC)的強度與細胞直徑成正相關，可以理解為細胞直徑越大，FSC越強，細胞直徑越小，FSC越弱。側向角散射光(SSC)的強度與細胞內顆粒結構復雜程度成正相關，可以理解為細胞內顆粒結構越復雜，SSC越強，細胞內顆粒結構越簡單，SSC越弱。而熒光信號的強度則與所待測細胞與熒光染料結合程度有關。

最后計算機分析系統會對接收的不同電信號進行分析處理，檢測結果最后用單參數峰、雙參數散點圖、三維立體圖等來表示。

二、分選型流式細胞儀檢測原理

通過分析檢測細胞，判斷是否需要將液滴進行分選。在將這些細胞液滴轉變成獨立液滴之前，對其進行相應處理以賦予特定電荷。這些帶電荷的獨立液滴在強電場中會發生偏移，然后進入相應的收集管中。未被收集的液滴將被處理為廢液，實現流式細胞分選。

流式細胞儀結構

流式細胞儀包括分析型和分選型兩種類型

1、分析型由液流系統、光路檢測系統、檢測分析系統組成

2、分選型由液流系統、光路檢測系統、檢測分析系統、分選系統組成

液流系統：由鞘液流和樣品流構成,鞘液流從鞘液桶開始,流過專門的管道進入噴嘴,經過噴嘴的小孔形成穩定的可見液流。

檢測分析系統：主要是對各個通道收集到的光信號進行匯總分析,通過分析得到樣品中所有細胞的理化特征,最后以各種圖譜進行結果展示。

光路檢測系統：包括激光、透鏡和光學信號檢測器。激光從激光器發出,照射到樣品流中的細胞會產生散射光,如果細胞上結合有熒光素,若可以被激光激發,熒光素則會向四周發射熒光。散射光信號包括正對激光方向接收的前向角散射光(FSC)和與激光方向在同一個水平面并與激光成90°角的側向角散射光(SSC),熒光信號與SSC接收方向相同。

分選系統：位于液流可見部分,是在噴嘴處多了一個高速振蕩器,在分選過程中使用噴嘴高速振蕩,帶動從噴嘴流出的可見液流高速振蕩,從而使可見液流在下段形成相互獨立的液滴而不是連續的液流。

流式細胞術實驗步驟

1、樣本準備樣本可以來源于組織、血液或其他液體，最終均需制備成單細胞懸液，便于染色和檢測。

2、細胞染色流式檢測需要對細胞進行染色以標記特異性抗原。

染色方法大體分為兩類：表面抗原直染、胞內抗原染色。表面抗原直染時，細胞和熒光偶聯抗體直接孵育即可；胞內抗原染色時，需進行固定和破膜后再和熒光偶聯抗體孵育。

3、細胞洗滌
在染色過程中，需要使用洗滌液對細胞進行洗滌以去除未結合的抗體和其他雜質。洗滌液一般使用預冷PBS，可選擇性加入2%BSA或2%FBS以提高細胞處理中的存活率。通過洗滌可以減少非特異性結合和背景干擾，提高實驗的特異性和準確性。

4、細胞固定

對于胞內抗原檢測，可以使用固定液（如4%多聚甲醛）和破膜劑（如0.1% Triton X-100）對細胞進行固定和打孔。固定液可以減少細胞的活性和變形，保持細胞的形態和抗原位置的穩定性。破膜劑有利于抗體進入與待測抗原結合。

在采集期間，細胞會通過激光器激發標記物產生熒光，而這些信號會被檢測器捕獲。收集的數據通常以FCS(Flow Cytometry Standard) 文件的形式保存。通過這些數據可以了解每個細胞的特性及其分布情況。

流式細胞術特點

1、速度快：通過對單個細胞或生物顆粒進行逐個檢測，測量速度可達每秒數千甚至上萬個細胞。

2、靈敏度高