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論文信息：

標題：A prospective study of neoadjuvant pembrolizumab plus chemotherapy for resectable esophagealsquamous cell carcinoma: The Keystone-001 trial

期刊：Cancer Cell

影響因子：48.8

作者：Xiaobin Shang, Yongjie Xie, Jinpu Yu3, Jun Yu, yujun, Jihui Hao, Haojihui, Hongjing Jiang

發(fā)表日期：2024年10月

doi: 10.1016/j.ccell.2024.09.008

關(guān)鍵詞：食管鱗狀細胞癌; 免疫檢查點抑制劑; 單細胞RNA測序; T細胞受體γ鏈恒定區(qū)2, 新輔助治療

實驗設(shè)計總覽

01

研究隊列

入組標準：

?組織學(xué)確診為可切除（II-III期）食管鱗癌（ESCC）

? PD-L1 CPS ≥1（部分亞組分析要求）

?未接受過系統(tǒng)性抗腫瘤治療

02

治療方案與手術(shù)

(1)新輔助階段：

帕博利珠單抗（200mg IV，Q3W） + 化療（紫杉醇 175mg/m2 + 順鉑 75mg/m2），共3周期。

(2)手術(shù)階段：

新輔助治療后4-6周行機器人輔助食管癌根治術(shù)（Ivor Lewis術(shù)式）。

(3)術(shù)后治療：

實驗組繼續(xù)帕博利珠單抗輔助治療（≤1年）。

03

療效評估指標

結(jié)果

01

Figure1 

圖1. Keystone-001研究的臨床結(jié)局分析

(A) 患者流程圖（Patient flow diagram）描述患者篩選、入組、排除及最終分析隊列的流程。

(B) 泳道圖（Swimmer plots）意向治療人群（ITT，Intention-To-Treat population，n = 47）中每位患者的治療時間線：新輔助治療階段（帕博利珠單抗聯(lián)合化療的用藥周期與持續(xù)時間）,輔助治療階段（術(shù)后帕博利珠單抗維持治療）,病理學(xué)結(jié)果（如主要病理緩解MPR、腫瘤殘留比例）和隨訪狀態(tài)（復(fù)發(fā)、死亡或生存）。(C) 總生存期（OS）的Kaplan-Meier曲線（Kaplan-Meier curves of Overall Survival）展示接受帕博利珠單抗（Pembrolizumab）聯(lián)合化療新輔助治療并后續(xù)手術(shù)患者的總生存期（從入組至任何原因死亡的時間）。(D) 無病生存期（DFS）的Kaplan-Meier曲線（Kaplan-Meier curves of Disease-Free Survival）。

02

圖2. 探索與對新輔助治療的差異反應(yīng)相關(guān)的特征性細胞亞群變化

(A)單細胞測序分析的工作流程圖。(B)氣泡圖顯示了從提交給分析以進行分析的樣本中獲得的單細胞測序數(shù)據(jù)的聚類分析。(C)-t分布隨機鄰域嵌入（t-SNE）圖顯示細胞聚類分析，使用Seurat的t-SNE算法對所有樣本進行注釋可視化。（D-G）t-SNE圖顯示了基于外周血來源(D)、腫瘤來源(E)、患者來源(F)和治療反應(yīng)(G)的細胞亞群。(H)條形圖顯示每個患者的每個細胞亞組按治療反應(yīng)所占的比例。(I)外周血和腫瘤組織中TRGC2+ NKT細胞的比例。箱形圖分別顯示了良好反應(yīng)組和不良反應(yīng)組在腫瘤組織和外周血中TRGC2+ NKT中的細胞比例。(J)有利反應(yīng)組和不良反應(yīng)組分別在治療前后顯示總NKT和TRGC2+ NKT的細胞比例的箱形圖。

03

圖3.外周血TRGC2+ NKT細胞群與對新輔助治療的反應(yīng)之間的關(guān)聯(lián)。

(A)條形圖顯示了基于治療反應(yīng)的每個患者的細胞群比例。(B)顯示所有NKT細胞群中差異表達基因的熱圖。(C)氣泡圖顯示了TRGC2+ NKT細胞中的KEGG分析。(D)火山圖顯示了標記不同NKT細胞亞群差異的功能基因。從左到右分別是：TRGC2+ NKT細胞、IL7R+ CCR4+ NKT細胞、CD69+ NKT細胞、CCL4+ IFNG+ NKT細胞、CXCR4+ NKT細胞和PDCD1+ TIGIT+ NKT細胞。(E)顯示不同NKT細胞亞群的偽時間軌跡的軌跡圖。(F)曼哈頓圖顯示關(guān)鍵基因TRGC2、RRM2、IL7R、TK1、FGFBP2和NKG7的表達軌跡，紅色表示TRGC2+ NKT細胞群。(G)全面的偽時間軌跡熱圖和通路富集圖，顯示了NKT細胞群中TRGC2+ NKT細胞群的特征功能、關(guān)鍵基因軌跡、通路富集分析和分化狀態(tài)。

04

圖4.外周血和腫瘤組織中TRGC2+ NKT細胞亞組

(A)-分布隨機鄰包埋（(A)-SNE）圖。(B) t-SNE圖比較了兩組患者在腫瘤組織中TRGC2+ NKTs的分布密度和比例的變化，并通過t-SNE圖進行可視化。(C)火山圖分別顯示了腫瘤組織和外周血中TRGC2+ NKT在有利組和不利組之間的差異表達基因，以及TRGC2+ NKT在外周血和腫瘤組織之間的差異表達基因。(D)熱圖說明綜合聚類分析結(jié)果顯示組間基因表達特征。功能通路富集分析揭示了涉及差異表達基因的信號通路。(F)箱形圖顯示了三個不同的功能TRGC2+ NKT細胞組在有利反應(yīng)組和不利反應(yīng)組之間的比例。(G)條形圖顯示了腫瘤內(nèi)三個細胞亞組在有利反應(yīng)組和不良反應(yīng)組之間的基因集評分的分布。(H)顯示外周血中幼稚TRGC2+ NKT細胞亞群的時間分化軌跡的軌跡圖。(I)系統(tǒng)發(fā)育樹顯示了TRGC2+ NKT細胞亞群從外周血到腫瘤組織的進化軌跡。(J)曼哈頓圖顯示了在不同TRGC2+ NKT細胞亞群的進化軌跡上顯著改變的基因。(K)基因表達趨勢圖，顯示TRGC2+ NKT細胞亞群從外周血到腫瘤組織的分子表達趨勢。

05

圖5.TRGC2+NKT細胞在食管鱗狀細胞癌免疫治療反應(yīng)中作用的其他驗證

(A) 工作流程示例說明了從4個不同患者的外周血單個核細胞（PBMCs）中分離出的TRGC2+ NKT細胞。(C)細胞凋亡定量，數(shù)據(jù)顯示為直方圖。(D)方案從4例患者的PBMCs中分離TRGC2+和TRGC2- NKT細胞，然后分別與患者來源的類器官進行共培養(yǎng)實驗。（E和F）類器官caspase 3中細胞凋亡的定量熒光檢測；如圖所示的類器官來自4個。

PART 03

核心發(fā)現(xiàn)

本研究為一項前瞻性II期臨床試驗，納入47例局部晚期可切除食管鱗癌（ESCC）患者，采用 術(shù)前帕博利珠單抗（PD-1抑制劑）聯(lián)合標準化療序貫達芬奇機器人根治術(shù) 的創(chuàng)新策略。結(jié)果顯示：①安全性卓越：新輔助治療期間無≥3級免疫相關(guān)不良事件及手術(shù)延期，驗證方案耐受性。②病理緩解突破：46例完成治療患者中，主要病理緩解率（MPR）達72%（33/46），完全緩解率（pCR）為41%（19/46），顯著高于歷史新輔助化療數(shù)據(jù)（MPR約20%-30%）。③生存獲益顯著：中位隨訪27.2個月后，2年總生存率（OS）與無病生存率（DFS）分別升至91%和89%，刷新局部晚期ESCC生存紀錄。④機制深度解析：單細胞測序聯(lián)合多隊列驗證揭示 外周血TRGC2+ NKT細胞擴增 為療效預(yù)測關(guān)鍵標志物（AUC=0.86）；類器官共培養(yǎng)證實該亞群通過 IFN-γ/TNF-α雙信號軸 誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡；跨癌種分析提示其免疫激活表型具廣譜抗腫瘤潛力。

PART 04

創(chuàng)新點

本研究在食管鱗狀細胞癌（ESCC）治療領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)了以下創(chuàng)新性突破：

1. 治療策略革新  

率先將PD-1抑制劑（帕博利珠單抗）聯(lián)合化療應(yīng)用于III期可切除ESCC的新輔助治療，填補了該治療方案在早中期患者群體中的循證空白。通過中位27.2個月的長期隨訪證實，其2年總生存率（91%）與無病生存率（89%）顯著優(yōu)于歷史化療數(shù)據(jù)，為優(yōu)化臨床實踐提供了證據(jù)。

2. 全程管理理念創(chuàng)新

突破傳統(tǒng)療效評價框架，首次整合病理緩解率（MPR）、營養(yǎng)狀態(tài)評估與生活質(zhì)量評分等多維度指標，揭示新輔助治療通過改善機體免疫營養(yǎng)微環(huán)境提升治療耐受性，形成"療效-生存質(zhì)量"雙獲益模式。

3. 生物標志物發(fā)現(xiàn)  

運用單細胞多組學(xué)技術(shù)在國際上首次報道：外周血TRGC2+ NKT細胞動態(tài)變化與治療應(yīng)答顯著相關(guān)。通過類器官共培養(yǎng)模型及空間轉(zhuǎn)錄組分析，闡明該亞群通過IFN-γ/TNF-α軸激活抗腫瘤免疫循環(huán)的作用機制，為液體活檢指導(dǎo)精準治療奠定理論基礎(chǔ)。

3. 研究方法學(xué)創(chuàng)新

①創(chuàng)建"臨床隊列-單細胞測序-功能驗證"三位一體研究范式。

②縱向采集治療前后配對外周血與組織樣本構(gòu)建單細胞圖譜。

③結(jié)合TCR克隆追蹤與細胞通訊網(wǎng)絡(luò)解析免疫重塑規(guī)律。  

該研究實現(xiàn)了從臨床現(xiàn)象到分子機制的閉環(huán)驗證，推動ESCC治療進入免疫動態(tài)監(jiān)控時代。

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