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- 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)平臺(tái)
- 動(dòng)物飼養(yǎng) 疾病造模 行為學(xué)檢測(cè) 心功能 無(wú)創(chuàng)血壓 血常規(guī) 全自動(dòng)生化檢測(cè)等
- 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)平臺(tái)
- CCK8/MTT 原代細(xì)胞分離 流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞劃痕 侵襲 遷移 EDU染色 轉(zhuǎn)染 穩(wěn)定株篩選
細(xì)胞實(shí)驗(yàn)技能 | CCK-8實(shí)驗(yàn)最全操作步驟以及注意事項(xiàng)
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發(fā)表時(shí)間：2025-07-16
CCK-8是一種在細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中廣泛應(yīng)用的試劑，用于檢測(cè)細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性。它可以直接添加到細(xì)胞樣品中，無(wú)需預(yù)先配制各種成分。細(xì)胞增殖越快，顏色越深，表明毒性較小；而細(xì)胞毒性越大，則顏色越淺。對(duì)于相同的細(xì)胞類型，顏色的深淺（即生成的formazan的量）與細(xì)胞數(shù)量呈線性關(guān)系。
實(shí)驗(yàn)材料及試劑：
細(xì)胞
96孔細(xì)胞培養(yǎng)板
CO2培養(yǎng)箱
酒精燈
微量移液器
酶標(biāo)儀
CCK-8試劑盒等
實(shí)驗(yàn)步驟：
1、取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，制備成一定濃度的細(xì)胞懸液。每孔加入100μl至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。通常，細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每孔加入2×103個(gè)細(xì)胞/100μl，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)每孔加入5×103個(gè)細(xì)胞/100μl（具體每孔所用的細(xì)胞數(shù)目需根據(jù)細(xì)胞大小、增殖速度等因素決定）。貼壁細(xì)胞需在37℃培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)2-6小時(shí)，待細(xì)胞貼壁后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；懸浮細(xì)胞則無(wú)需預(yù)培養(yǎng)。
2、根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，在培養(yǎng)孔中加入0-10μl待測(cè)樣本，并繼續(xù)培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間。進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn)時(shí)，加入毒性物質(zhì)后的培養(yǎng)時(shí)間需根據(jù)毒性物質(zhì)的性質(zhì)和細(xì)胞的敏感性來(lái)確定，通常至少需要1-2代以上的時(shí)間。
3、向96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入10μl CCK-8溶液，并在37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育0.5-4小時(shí)。
4、測(cè)定吸光度。建議使用雙波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)波長(zhǎng)為430-490nm，參比波長(zhǎng)為600-650nm；或者采用450nm單波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)。
計(jì)算公式：
細(xì)胞存活率 = [(As - Ab) / (Ac - Ab)] × 100%
抑制率 = [(Ac - As) / (Ac - Ab)] × 100%
其中，As為實(shí)驗(yàn)孔吸光度（含細(xì)胞、培養(yǎng)基、CCK-8溶液和藥物溶液）；Ac為對(duì)照孔吸光度（含細(xì)胞、培養(yǎng)基、CCK-8溶液，不含藥物）；Ab為空白孔吸光度（含培養(yǎng)基、CCK-8溶液，不含細(xì)胞和藥物）。
注意事項(xiàng)：
（1）如果細(xì)胞起始的培養(yǎng)體積為200μl，則需加入20μl的CCK-8溶液，以此類推。
（2）建議每個(gè)藥物濃度孔設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，并取均值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
（3）設(shè)計(jì)好實(shí)驗(yàn)對(duì)照，以排除其他因素的干擾：
空白對(duì)照：使用含有等量細(xì)胞培養(yǎng)液、CCK-8溶液和藥物但沒(méi)有細(xì)胞的孔。
陰性對(duì)照：使用未加藥物但加了藥物溶劑的細(xì)胞孔。
（4）試劑盒的檢測(cè)依賴于脫氫酶催化的反應(yīng)。如果待測(cè)物質(zhì)具有氧化性或還原性，可能會(huì)干擾檢測(cè)結(jié)果，需設(shè)法去除其影響（可在加入CCK-8溶液之前更換新鮮培養(yǎng)基以去除藥物影響；如果藥物影響較小，可以不更換培養(yǎng)基，直接扣除培養(yǎng)基中加入藥物后的空白吸收）。
（5）加入CCK-8溶液后需注意孵育時(shí)間，該時(shí)間根據(jù)細(xì)胞類型和細(xì)胞密度等實(shí)驗(yàn)條件而定。初次實(shí)驗(yàn)時(shí)，可在0.5、1、2和4小時(shí)后分別用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)，并選擇一個(gè)吸光度范圍適宜的時(shí)間點(diǎn)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
（6）在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，培養(yǎng)板最外邊的孔容易干燥揮發(fā)，導(dǎo)致體積不準(zhǔn)確而增加誤差。因此，最外一圈的孔通常只加培養(yǎng)基，不作測(cè)定孔用。
（7）若暫時(shí)不測(cè)定OD值，可以向每孔中加入10μl 10% SDS溶液以終止反應(yīng)，并將培養(yǎng)板遮蓋避光保存在室溫條件下。建議在24小時(shí)內(nèi)進(jìn)行測(cè)定，雖然吸光度變化不會(huì)太大，但還是建議盡快進(jìn)行檢測(cè)。
（8）在使用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)之前，請(qǐng)確保每個(gè)孔內(nèi)沒(méi)有氣泡，否則會(huì)干擾測(cè)定結(jié)果。
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主營(yíng)項(xiàng)目
1. 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
動(dòng)物飼養(yǎng)、疾病造模、行為學(xué)檢測(cè)、心功能、無(wú)創(chuàng)血壓、血常規(guī)、全自動(dòng)生化檢測(cè)等
2. 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)
CCK8/MTT、原代細(xì)胞分離、流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕、侵襲、遷移、EDU染色、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定株
3. 分子生物學(xué)
PCR檢測(cè)、熒光定量PCR、絕對(duì)定量PCR、端粒酶長(zhǎng)度、pull down、雙熒光素酶、SSR、SNP檢測(cè)等
4. 蛋白實(shí)驗(yàn)
WB、Co-IP、酵母雙雜
5. 病理實(shí)驗(yàn)
HE染色、免疫組學(xué)、電鏡
6. 生理生化實(shí)驗(yàn)
肝腎功能、抗氧化、免疫反應(yīng)等生理免疫指標(biāo);動(dòng)植物營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)、微量元素、重金屬、酶活等。
7. 多組學(xué)實(shí)驗(yàn)
基因組、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白組、代謝組、微生物多樣性、宏基因組、生信分析
8. 整體課題實(shí)驗(yàn)
方案設(shè)計(jì)、整體實(shí)驗(yàn)交付、標(biāo)書寫作、論文潤(rùn)色、協(xié)助投稿
康旭禾生物提供包括動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、分子實(shí)驗(yàn)、病理實(shí)驗(yàn)、流式檢測(cè)實(shí)驗(yàn)及論文翻譯、潤(rùn)色、投稿輔助等相關(guān)的各項(xiàng)服務(wù)。
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