細胞實驗技能 | CCK-8實驗最全操作步驟以及注意事項
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發表時間：2025-07-16
CCK-8是一種在細胞生物學實驗中廣泛應用的試劑，用于檢測細胞增殖和細胞毒性。它可以直接添加到細胞樣品中，無需預先配制各種成分。細胞增殖越快，顏色越深，表明毒性較小；而細胞毒性越大，則顏色越淺。對于相同的細胞類型，顏色的深淺（即生成的formazan的量）與細胞數量呈線性關系。
實驗材料及試劑：
細胞
96孔細胞培養板
CO2培養箱
酒精燈
微量移液器
酶標儀
CCK-8試劑盒等
實驗步驟：
1、取生長狀態良好的細胞，制備成一定濃度的細胞懸液。每孔加入100μl至96孔細胞培養板中。通常，細胞增殖實驗每孔加入2×103個細胞/100μl，細胞毒性實驗每孔加入5×103個細胞/100μl（具體每孔所用的細胞數目需根據細胞大小、增殖速度等因素決定）。貼壁細胞需在37℃培養箱中預培養2-6小時，待細胞貼壁后再進行實驗；懸浮細胞則無需預培養。
2、根據實驗需求，在培養孔中加入0-10μl待測樣本，并繼續培養適當時間。進行細胞毒性試驗時，加入毒性物質后的培養時間需根據毒性物質的性質和細胞的敏感性來確定，通常至少需要1-2代以上的時間。
3、向96孔細胞培養板中每孔加入10μl CCK-8溶液，并在37℃培養箱中繼續孵育0.5-4小時。
4、測定吸光度。建議使用雙波長進行測定，檢測波長為430-490nm，參比波長為600-650nm；或者采用450nm單波長進行檢測。
計算公式：
細胞存活率 = [(As - Ab) / (Ac - Ab)] × 100%
抑制率 = [(Ac - As) / (Ac - Ab)] × 100%
其中，As為實驗孔吸光度（含細胞、培養基、CCK-8溶液和藥物溶液）；Ac為對照孔吸光度（含細胞、培養基、CCK-8溶液，不含藥物）；Ab為空白孔吸光度（含培養基、CCK-8溶液，不含細胞和藥物）。
注意事項：
（1）如果細胞起始的培養體積為200μl，則需加入20μl的CCK-8溶液，以此類推。
（2）建議每個藥物濃度孔設置3個復孔，并取均值進行數據分析。
（3）設計好實驗對照，以排除其他因素的干擾：
空白對照：使用含有等量細胞培養液、CCK-8溶液和藥物但沒有細胞的孔。
陰性對照：使用未加藥物但加了藥物溶劑的細胞孔。
（4）試劑盒的檢測依賴于脫氫酶催化的反應。如果待測物質具有氧化性或還原性，可能會干擾檢測結果，需設法去除其影響（可在加入CCK-8溶液之前更換新鮮培養基以去除藥物影響；如果藥物影響較小，可以不更換培養基，直接扣除培養基中加入藥物后的空白吸收）。
（5）加入CCK-8溶液后需注意孵育時間，該時間根據細胞類型和細胞密度等實驗條件而定。初次實驗時，可在0.5、1、2和4小時后分別用酶標儀進行檢測，并選擇一個吸光度范圍適宜的時間點用于后續實驗。
（6）在培養箱內培養細胞時，培養板最外邊的孔容易干燥揮發，導致體積不準確而增加誤差。因此，最外一圈的孔通常只加培養基，不作測定孔用。
（7）若暫時不測定OD值，可以向每孔中加入10μl 10% SDS溶液以終止反應，并將培養板遮蓋避光保存在室溫條件下。建議在24小時內進行測定，雖然吸光度變化不會太大，但還是建議盡快進行檢測。
（8）在使用酶標儀進行檢測之前，請確保每個孔內沒有氣泡，否則會干擾測定結果。
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