文獻解讀┃Nature Communications：揭示 SH3RF3 促進乳腺癌干細胞特性的機制
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發表時間：2025-07-16
01論文基本信息
標題：SH3RF3 promotes breast cancer stem-like properties via JNK activation and PTX3 upregulation
期刊：Nature Communications
影響因子：17.69
作者：Peiyuan Zhang, Yingjie Liu, Cheng Lian 等
發表日期：2020 年 5 月 19 日
DOI：10.1038/s41467-020-16051-9
關鍵詞：乳腺癌干細胞；SH3RF3；JNK 通路；PTX3
02研究背景
癌癥嚴重威脅人類健康，腫瘤異質性使得癌癥治療面臨挑戰，癌癥干細胞（CSCs）理論為解釋腫瘤異質性提供了思路。乳腺癌干細胞（BCSCs）在乳腺癌的發生、發展、復發和轉移中起關鍵作用，目前對其調控機制的了解尚不完整。SH3RF3 是一種含有多個結構域的蛋白質，其在癌癥中的功能尚未明確，PTX3 在癌癥中的作用存在爭議 。
03實驗設計
篩選關鍵分子
通過流式細胞術分選 HMLER 細胞系，得到具有不同 BCSC 特性的亞群，進行轉錄組分析篩選與 BCSCs 相關的分子；分析公共轉錄組數據集，確定與臨床腫瘤 BCSC 特性相關的基因，并與細胞系數據交叉分析，篩選出關鍵基因 SH3RF3。
功能驗證
構建過表達和敲低 SH3RF3 的細胞模型，檢測 BCSCs 相關指標（如 CD44+CD24 - 細胞比例、ALDH + 細胞比例、腫瘤球形成能力、體內成瘤能力等），驗證 SH3RF3 對 BCSCs 特性的影響；構建過表達和敲低 PTX3 的細胞模型，檢測其對 BCSCs 特性的影響，并通過 rescue 實驗驗證 PTX3 在 SH3RF3 調控 BCSCs 中的作用。
機制探究
運用 RNA 測序、ChIP-qPCR、熒光素酶報告實驗、Co-IP 等實驗，探究 SH3RF3 調控 PTX3 表達的信號通路及分子機制；分析 SH3RF3 與 JNK 信號通路相關蛋白的相互作用，確定 SH3RF3 激活 JNK-JUN 通路的機制。
臨床相關性分析
培養患者來源的類器官，觀察 SH3RF3 過表達對其形成的影響；分析 TCGA 乳腺癌隊列、Qilu 隊列數據及 Kaplan-Meier Plotter 數據庫，探究 SH3RF3 表達與 BCSCs 特性、患者預后的相關性。
04實驗結果
圖 1：SH3RF3 表達與 BCSC 特性相關
a：HMLER 亞系衍生流程圖及代表性圖像。比例尺，100μm。
b：HMLER 亞系中腫瘤球的定量分析（n=3 次培養實驗）及代表性圖像。比例尺，100μm。
c：不同濃度紫杉醇（0 - 200ng/mL）和阿霉素（0 - 500nM）處理后，HMLER 亞系的 MTT 檢測結果（n=4 次處理實驗）。
d：HMLER 亞系中 CD44+CD24 - 和 ALDH+ CSCs 的流式細胞術分析。圖中數字表示相應亞群的百分比。
e：臨床腫瘤和 HMLER 亞系中與 CSC 特性相關的基因。熱圖展示了它們在 HMLER 亞系中的表達、與 TCGA 腫瘤中 CSC 特征的皮爾遜相關性（Corr_r）以及腫瘤球與原發腫瘤中表達的對數倍數變化（logFC）。
f：來自 HMLER、HMLE 和 MCF10AT 不同亞系中 SH3RF3 的表達（n=3 次細胞培養）。數據表示為平均值 ± 標準差。采用雙尾無配對 t 檢驗確定統計學意義（b、c 和 f）。（b）和（f）中的實驗獨立重復三次，結果相似，展示其中一次代表性實驗的數據
●細胞亞群分選及特性鑒定：通過流式細胞術將 HMLER 細胞系分為 CD44H（CD44+CD24-）和 CD44L（CD44-CD24+）亞群，對 CD44L 細胞連續進行腫瘤球培養獲得 CD44LS 亞群。CD44H 和 CD44LS 亞群的腫瘤球形成能力增強，對化療藥物（紫杉醇、阿霉素）耐藥性提高，且 CD44H 主要為 CD44+CD24-，CD44LS 細胞的 ALDH 表達更高，表明成功富集了具有不同 BCSC 特性的亞群。
●基因篩選與驗證：對 CD44L、CD44H 和 CD44LS 進行 RNA 測序，分析差異表達基因。結合 TCGA 乳腺癌隊列及患者來源腫瘤球與原發腫瘤的轉錄組數據集，篩選出 76 個與 CD44+CD24 - 特征和腫瘤球形成能力相關的基因，其中 21 個基因與 HMLER 亞系中鑒定的 CSC 相關基因重疊，SH3RF3 是其中之一。qRT-PCR 和 Western blot 分析證實 SH3RF3 在多種細胞系的 BCSC 亞群（如 HMLER 的 CD44H 和 CD44LS、HMLE 和 MCF10AT 的 CD44+CD24 - 亞群）中表達上調。
圖 2：SH3RF3 促進乳腺癌細胞的 CSC 特性
a：HMLE、MCF10AT 和 MDA-MB-231 細胞中 SH3RF3 的過表達情況。
b：HMLE 和 MCF10AT 中 CD44+CD24 - 亞群以及 MDA-MB-231 中 ALDH + 亞群的流式細胞術分析。圖中數字表示 CSC 百分比（n=3 次培養實驗）。
c：過表達 SH3RF3 的乳腺癌細胞中腫瘤球形成的定量分析及代表性圖像（n=3 次培養實驗）。比例尺，100μm。
d：在第 28 天，注射連續稀釋的 MDA-MB-231 細胞的小鼠體內腫瘤形成情況。
e：注射 40 個對照和過表達 SH3RF3 的 MDA-MB-231 細胞的小鼠的腫瘤圖像和體積（n=10 只小鼠）。數據表示為平均值 ± 標準差。采用雙尾無配對 t 檢驗（b 和 c）、卡方檢驗（d）或 Mann-Whitney U 檢驗（e）確定統計學意義。（a）、（b）（上）和（c）中的實驗獨立重復三次，結果相似，展示其中一次代表性實驗的數據。
●細胞系實驗：在 HMLE、MCF10AT 和 MDA-MB-231 細胞中過表達 SH3RF3，結果顯示 CD44+CD24 - 細胞在 HMLE 和 MCF10AT 中比例增加，MDA-MB-231 中 ALDH + 亞群增多，且這三種細胞系的腫瘤球形成能力均顯著增強。在小鼠乳腺癌細胞系 Py8119 中，Sh3rf3 在 ALDH + 亞群中表達上調，過表達 Sh3rf3 也增強了其腫瘤球形成能力。
●體內成瘤實驗：將過表達 SH3RF3 的 MDA-MB-231 細胞和對照細胞進行有限稀釋后原位移植到免疫缺陷小鼠體內。當注射較少細胞（如 40 個細胞）時，過表達組小鼠的腫瘤發生率更高，腫瘤體積更大，CSC 頻率顯著增加；在 HMLER 細胞中過表達 SH3RF3 也得到類似結果，表明 SH3RF3 過表達促進乳腺癌細胞在體內的腫瘤起始能力。
圖 3：SH3RF3 敲低損害乳腺癌細胞的 CSC 特性
a：HMLER-CD44H 和 MCF10CA1h 細胞中 SH3RF3 的敲低情況。
b：HMLER-CD44H 中 CD44high 亞群和 MCF10CA1h 中 ALDH + 亞群的流式細胞術分析（n=3 次細胞培養實驗）。
c：敲低 SH3RF3 的乳腺癌細胞中腫瘤球形成的定量分析及代表性圖像（n=3 次球培養實驗）。比例尺，100μm。
d：在第 42 天，注射連續稀釋的 MCF10CA1h 細胞的小鼠體內腫瘤形成情況。
e：注射 200 個對照或敲低 SH3RF3 的 MCF10CA1h 細胞的小鼠的腫瘤圖像和體積（n=8 只小鼠）。數據表示為平均值 ± 標準差。采用雙尾無配對 t 檢驗（b 和 c）、卡方檢驗（d）或 Mann-Whitney U 檢驗（e）確定統計學意義。（a）、（b）（左）和（c）中的實驗獨立重復三次，結果相似，展示其中一次代表性實驗的數據。
●敲低效果驗證：在 HMLER-CD44H 和 MCF10CA1h 細胞系中使用多種 siRNAs 或 shRNAs 敲低 SH3RF3，Western blot 結果顯示敲低效果顯著。
●功能影響：敲低 SH3RF3 后，HMLER-CD44H 細胞中 CD44 高表達亞群比例明顯下降，MCF10CA1h 細胞中 ALDH + 亞群顯著減少，兩種細胞系的腫瘤球形成能力均受損。
●體內實驗：對敲低 SH3RF3 的 MCF10CA1h 細胞進行有限稀釋后原位移植到小鼠體內，結果顯示敲低組小鼠的腫瘤起始能力顯著降低，腫瘤體積更小，表明 SH3RF3 對維持乳腺癌細胞的 CSC 特性至關重要。
圖 4：PTX3 受 SH3RF3 調控并增強 BCSC 特性
a：HMLER 亞系中差異表達且受 SH3RF3 過表達調控的基因的表達熱圖。
b：過表達和敲低 SH3RF3 后，不同癌細胞系中 PTX3 mRNA 表達及其細胞外蛋白水平（n=3 次細胞培養）。
c：乳腺癌細胞系中 SH3RF3 和 PTX3 mRNA 水平的相關性（n=51 個細胞系）。
d：過表達 PTX3 和對照的 HMLE 細胞條件培養基中細胞外 PTX3 水平。
e：過表達 PTX3 后 HMLE 細胞的腫瘤球形成情況（n=3 次培養實驗）。
f、g：過表達 PTX3 和對照的 HMLE 細胞中 CD44+CD24- CSC 亞群的流式細胞術分析（f）和定量分析（g）。比例尺，100μm；n=3 次細胞培養實驗。
h：注射不同數量 HMLER 細胞的小鼠在第 90 天的腫瘤發生率。
i：過表達 PTX3 與對照細胞中 CSC 和 MaSC 相關基因集的 GSEA 分析。
j：過表達 PTX3 與對照細胞中 Hedgehog 和 Hippo 調控基因集的 GSEA 分析。
k：過表達 PTX3 后 Hedgehog 和 Hippo 調控基因的 mRNA 水平（n=3 次細胞培養實驗）。數據表示為平均值 ± 標準差。采用配對 t 檢驗（c）或雙尾無配對 t 檢驗（e、g 和 k）確定統計學意義。（b）、（d）、（e）、（f）和（k）中的實驗獨立重復三次，結果相似，展示其中一次代表性實驗的數據。
●篩選與驗證：對過表達 SH3RF3 的 MCF10AT 細胞進行 RNA 測序，與 HMLER 亞系差異表達基因重疊分析后，確定 PTX3 為關鍵基因。過表達和敲低 SH3RF3 實驗表明，PTX3 在 RNA 和蛋白質水平受 SH3RF3 調控。分析癌細胞系表達數據庫發現，SH3RF3 和 PTX3 在乳腺癌細胞系中的表達呈強正相關。
●PTX3 功能驗證：在 HMLE、HMLER 和 MCF10AT 細胞中過表達 PTX3，細胞的腫瘤球形成能力增強，HMLE 中 CD44+CD24 - 亞群比例增加，HMLER 的體內成瘤能力提高。
●通路分析：對過表達 PTX3 的 HMLER 細胞進行 RNA 測序和 GSEA 分析，發現與 CSC 和乳腺干細胞（MaSC）相關的基因集在過表達 PTX3 的細胞中顯著富集，同時 Hedgehog 和 YAP 信號通路相關基因集也顯著富集，qRT-PCR 驗證了相關基因的上調，表明 PTX3 可能通過調控這些通路發揮作用。
圖 5：PTX3 介導 SH3RF3 在 BCSC 調控中的功能
a：乳腺癌細胞系中，PTX3 和 SH3RF3 過表達后調控的基因集的 ssGSEA 得分的相關性（n=51 個細胞系）。
b：過表達 PTX3 與對照細胞中 CD44 或 YAP 相關基因集的 GSEA 分析。
c：PTX3 和 SH3RF3 過表達后 Hedgehog 和 Hippo 調控基因的表達熱圖。
d：過表達 SH3RF3 的 MDA-MB-231 細胞中 PTX3 的敲低情況。
e：過表達 SH3RF3 且敲低 PTX3 的 MDA-MB-231 細胞中 ALDH + 亞群的流式細胞術分析。
f：過表達 SH3RF3 且敲低 PTX3 的 MDA-MB-231 細胞中 ALDH+ CSC 亞群的定量分析（n=4 次 FACS 實驗）。
g：過表達 SH3RF3 且敲低 PTX3 的 MDA-MB-231 細胞中腫瘤球定量分析（n=3 次培養實驗）。
h：在第 28 天，注射 40 個 MDA-MB-231 細胞的小鼠的腫瘤起始情況。數據表示為平均值 ± 標準差，n=3。采用配對 t 檢驗（a）或雙尾無配對 t 檢驗（f 和 g）確定統計學意義。（d）、（e）和（g）中的實驗獨立重復三次，結果相似，展示其中一次代表性實驗的數據。
●轉錄組相關性分析：ssGSEA 分析顯示，在乳腺癌細胞系中，SH3RF3 和 PTX3 過表達調控的基因集的 ssGSEA 得分具有強相關性，且 PTX3 過表達細胞中富集的基因集在 SH3RF3 過表達時也顯著富集，同時 SH3RF3 過表達也調控了 PTX3 調節的 Hedgehog 和 Hippo-YAP 下游基因，表明兩者對癌細胞轉錄組的影響一致，尤其在與癌癥干性相關基因方面。
●rescue 實驗：在 MDA-MB-231 細胞中敲低 PTX3，流式細胞術分析顯示，SH3RF3 過表達引起的 ALDH+ CSC 亞群擴張被抑制，腫瘤球形成能力也受到顯著抑制。在體內實驗中，敲低 PTX3 抑制了 SH3RF3 過表達對 MDA-MB-231 細胞體內成瘤的促進作用，表明 PTX3 在 SH3RF3 調控 BCSCs 中起關鍵介導作用。
圖 6：SH3RF3 通過 JNK-JUN 通路增強 PTX3 表達
a、b：用 JNK（SP600125，5nM）、WNT（XAV939，5nM）和 NF-κB（BAY11-7082，5nM）抑制劑處理過表達 SH3RF3 和對照的 HMLE 細胞后，PTX3 表達（a）和腫瘤球形成（b，n=3 次培養實驗）情況。
c、d：用 JNK 抑制劑處理過表達 SH3RF3 和對照的 MDA-MB-231 細胞后，PTX3 表達（c）和腫瘤球形成（d，n=3 次培養實驗）情況。
e：過表達和敲低 SH3RF3 后 JNK 和 JUN 的磷酸化情況。
f：過表達 SH3RF3 后 HMLE 中 JUN 靶基因的表達（n=3 次 qRT-PCR 實驗）。
g：HeLa 細胞中 JUN 與 PTX3 啟動子結合的 ChIP-qPCR 分析（n=3 次 ChIP 實驗）。
h：JUN 過表達和對照的 HeLa 細胞中 PTX3 啟動子的熒光素酶報告分析（n=3 次報告實驗）。數據表示為平均值 ± 標準差。采用雙尾無配對 t 檢驗（a、b、d、f、g 和 h）確定統計學意義。（a - f）和（g）中的實驗獨立重復三次，結果相似，展示其中一次代表性實驗的數據。
●通路篩選：用 PI3K、JNK、WNT 和 NF-κB 通路抑制劑處理 HMLE 細胞，發現 JNK 抑制劑（SP600125）能顯著抑制 PTX3 表達和腫瘤球形成，消除 SH3RF3 的促進作用，而 PI3K 抑制劑雖抑制 PTX3 表達，但 SH3RF3 仍能上調 PTX3 表達和促進腫瘤球形成，且 SH3RF3 不影響 AKT 磷酸化，表明 SH3RF3 通過 PI3K 非依賴途徑調控 PTX3。
●JNK 通路激活驗證：在多種細胞系中過表達 SH3RF3，JNK1、JNK2 及下游轉錄因子 JUN 的磷酸化水平增加；敲低 SH3RF3 則抑制 JNK 和 JUN 的磷酸化。同時，過表達 SH3RF3 使已知的 JUN 靶基因（如 MMP3、CD44 等）顯著上調。
●JUN 與 PTX3 關系驗證：ChIP-qPCR 實驗證實 JUN 能結合 PTX3 啟動子，熒光素酶報告實驗表明 JUN 可直接激活 PTX3 啟動子轉錄活性，且 JUN 主要靶向 PTX3 啟動子的 - 206 到 + 52 區域，該區域的三個 AP-1 結合位點對 JUN 調控 PTX3 表達至關重要。
圖 7：SH3RF3 通過與 MKK 和 JNK 相互作用激活 JUN
a：293T 細胞中 SH3RF3 與 JNK1/2 相互作用的 Co-IP 分析。
b：293T 細胞中 SH3RF3 與 MKK4/7 相互作用的 Co-IP 分析。
c：293T 細胞中 SH3RF3 與 JIP3 相互作用的 Co-IP 分析。
d：293T 細胞中 SH3RF3-JIP3-MKK7 相互作用的順序 Co-IP 分析。
e：MCF10AT 中 JIP3 與 MKK7 相互作用的 Co-IP 分析（上），以及過表達 SH3RF3 與否的情況（下）。
f：敲低 JIP3 與否的 MCF10AT 中 SH3RF3 與 JNK1/2 相互作用的 Co-IP 分析。
g：過表達 SH3RF3 和敲低 JIP3 后 MCF10AT 中 JUN 的磷酸化情況。
h：不同 SH3RF3 截斷體與 MKK7、JIP3 和 JNK1 相互作用的 Co-IP 分析。實驗獨立重復三次，結果相似，展示其中一次代表性實驗的數據。
●相互作用驗證：Co-IP 實驗表明 SH3RF3 與 JNK1、JNK2 以及 MKK4、MKK7 存在相互作用，同時 SH3RF3 能與 JIP 家族成員 JIP1、JIP2、JIP3 相互作用，在乳腺癌細胞 MCF10AT 中主要表達 JIP3，且 SH3RF3、MKK7 和 JIP3 存在于同一復合物中。
● 作用機制探究：SH3RF3 增強 JIP3 與 MKK7 的相互作用，但不影響 JIP3-JNK2 相互作用。敲低 JIP3 顯著削弱 SH3RF3 與 JNK 蛋白的結合以及 SH3RF3 促進 JUN 磷酸化的作用。進一步研究發現，SH3RF3 的第四個 SH3 結構域與 MKK7 相互作用，第一和第二個 SH3 結構域分別與 JIP3 和 JNK1 相互作用，表明 SH3RF3 通過促進 MKK-JNK 復合物的組裝激活 JNK-JUN 通路。
圖 8：SH3RF3 在人類乳腺腫瘤中的臨床相關性
a：過表達 SH3RF3 后，人乳腺腫瘤 LTMBC-1 來源的患者類器官形成情況（n=3 次類器官培養重復）。（右圖）線表示中位數， whiskers 表示標準差。右圖展示了一個代表性類器官的蘇木精 - 伊紅染色。比例尺，100μm。
b：過表達 SH3RF3 后，另外兩個人乳腺腫瘤（LTMBC-2 和 3）來源的患者類器官形成情況（n=3 次類器官培養重復）。
c：過表達 SH3RF3 后，四個人胃癌（LTMGC-1、2、4 和 13）來源的患者類器官形成情況（n=3 次類器官培養重復）。比例尺，100μm。
d：TCGA 乳腺癌隊列中 SH3RF3 和 PTX3 表達與不同 CSC 標記基因的相關性（n = 1097 例患者）。
e：TCGA 乳腺癌隊列中 SH3RF3 表達與 CSC 和 MaSC 相關基因集的 ssGSEA 得分的相關性（n = 1097 例患者）。
f：Qilu 隊列乳腺癌組織中 SH3RF3 和 CD44 的代表性 IF 圖像。比例尺，100μm。
g：Qilu 隊列中不同 SH3RF3 表達的乳腺癌組織中 CD44 表達水平（n = 40 例患者）。括號中的數字表示樣本量。
h：Qilu 隊列乳腺癌組織中 SH3RF3 和 CD44 IF 強度的相關性（n = 40）。
i：通過 Kaplan-Meier Plotter 乳腺癌隊列（n = 626 例患者）中 SH3RF3 表達進行的生存分析。
j：SH3RF3 在 BCSC 調控中作用的示意圖模型。數據表示為平均值 ± 標準差。采用雙尾無配對 t 檢驗（a、b 和 c）、卡方檢驗（g）、配對 t 檢驗（h）或雙側對數秩檢驗（i）確定統計學意義。
●類器官實驗：在患者來源的乳腺癌類器官培養實驗中，過表達 SH3RF3 顯著增加了三個乳腺癌患者來源腫瘤細胞形成的類器官數量和大小，在胃癌類器官培養中也得到類似結果，表明 SH3RF3 促進臨床腫瘤細胞的 CSC 特性。
●臨床數據分析：分析 TCGA 乳腺癌隊列 RNA 測序數據，發現 SH3RF3 表達與 PTX3、CSC 標記基因（CD44、ALDH1A1/2/3）呈正相關，且 SH3RF3 表達與 CSC 和 MaSC 相關基因集的富集正相關。
●免疫熒光分析：對 40 例乳腺浸潤性導管癌的 Qilu 隊列進行免疫熒光染色，結果顯示 SH3RF3 表達越高，CD44 + 細胞數量越多，兩者信號強度呈正相關。
●預后分析：通過 Kaplan-Meier Plotter 數據庫分析，發現 SH3RF3 高表達與乳腺癌患者遠處轉移風險增加和生存率降低相關；在 CPTAC 乳腺癌隊列中，PTX3 高表達與疾病復發相關。
05研究結論
SH3RF3 在乳腺癌干細胞中高表達，通過激活 JNK-JUN 通路上調 PTX3 表達，促進乳腺癌細胞的干細胞特性，與臨床腫瘤的 CSC 富集和患者不良預后相關，為乳腺癌的治療提供了潛在的新靶點和理論依據，但 PTX3 下游分子機制及 SH3RF3 在 JNK 信號通路中的具體作用仍需進一步研究 。
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7. 多組學實驗
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