干貨分享丨細胞培養簡單攻略-復蘇/傳代/凍存
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發表時間：2025-07-24
細胞培養是指將細胞從動物或植物體內取出，然后在適宜的人工環境中生長的過程。細胞可以在培養前直接從組織中取出并通過酶或機械方法進行解離，也可以來源于已建立的細胞系或細胞株。
細胞培養又具體分為細胞傳代、換液、凍存、復蘇等一系列過程，每個步驟都對應著不同的操作技術要點，想要養好細胞，每一步都必須掌握。
1. 細胞復蘇
細胞復蘇是指將休眠的細胞重新活化，使之重新生長，分裂產生子細胞的過程。復蘇后的細胞可重新進入細胞周期，獲得細胞類型特異的生物學功能。復蘇細胞一般采用快速融化法，以保證細胞外結晶快速融化，避免慢速融化產生的水分滲入細胞內，再次形成胞內結晶損傷細胞。
操作步驟：
1. 從液氮中取出凍存的細胞，迅速將凍存管放入37℃水浴快速融解。
2. 在生物安全柜或超凈臺中，將解凍后的細胞懸液緩慢加入5mL預溫的細胞培養基（推薦產品：埃澤思人間充質干細胞培養基 AC-1001003）。
3. 1200rpm 離心3min，吸掉上清，加入10mL培養基重懸細胞。
4. 將細胞均勻鋪到培養皿中，水平十字振動培養皿使細胞均勻分布，5% CO2的 37℃恒溫細胞培養箱中培養24小時后觀察細胞狀態。
5. 24h后更換新鮮細胞培養基繼續培養，每2-3天更換培養液。
注意細節：
1. 從液氮罐中拿出凍存管時要做好防護工作，需配備防凍手套和護目鏡；
2. 水浴鍋溫度：嚴格控制在37℃，且解凍時凍存管管口切勿浸沒到水中；
3. 復蘇接種密度：一管細胞（1×106個）接種到1個T25（底面積25cm2）中，搖勻后置于37℃、5%CO2的培養箱中培養。
2. 細胞傳代培養
傳代培養中的細胞傳代培養，當原代培養成功以后，隨著培養時間的延長和細胞不斷分裂，一則細胞之間相互接觸而發生接觸性抑制，生長速度減慢甚至停止另一方面也會因營養物不足和代謝物積累而不利于生長或發生中毒。此時就需要將培養物分割成小的部分，重新接種到另外的培養器皿(瓶)內，再進行培養。這個過程就稱為傳代或者再培養。對單層培養而言，80%匯合或剛匯合的細胞是較理想的傳代階段。
操作步驟：
1. 在顯微鏡下觀察細胞，當細胞融合度達到 90%，即可傳代。
2. 在超凈臺/安全柜中，吸掉原有培養基，加入PBS 溶液清洗一次，加入細胞消化液（
推薦產品：埃澤思細胞消化液 AC-1001024）使之完全覆蓋皿/瓶底。
3. 室溫孵育4-5分鐘或37℃孵育2-4分鐘，顯微鏡下觀察大部分細胞脫離皿底即停止消化。
4. 加入消化液2倍體積的人間充質干細胞培養基，用移液器輕輕吹打瓶壁上未完全脫離的細胞，并輕輕吹打混勻，使細胞完全分散。
5. 將細胞懸液轉移到15mL離心管中，1200rpm離心3min。
6. 棄上清，加入人間充質干細胞培養基，重懸細胞，計數。1:3-1:4比例傳代，或按1-2x
104cells/c㎡傳代，均勻鋪在培養皿/瓶中，置于37℃，5%CO2培養箱中培養。
注意細節：
1. 細胞傳代所需的時間:2-4天。5代及之前的細胞，生長速度較快。5 代以后的細胞，生長速度稍緩；
2. 消化時間需要同時考慮到細胞本身特性，細胞密度，胰酶濃度等多方面因素，靈活調整，切忌生搬硬套；
3. 傳代過程中加入任何試劑都應該輕柔緩慢的加到皿壁，切忌直接加到細胞面上，如果細胞本身貼壁能力較差，可能導致細胞凋亡。
3. 細胞凍存
細胞凍存是細胞保存的主要方法之一。利用凍存技術將細胞置于-196℃液氮中低溫保存，可以使細胞暫時脫離生長狀態而將其細胞特性保存起來，這樣在需要的時候再復蘇細胞用于實驗。而且適度地保存一定量的細胞，可以防止因正在培養的細胞被污染或其他意外事件而使細胞丟種，起到了細胞保種的作用。除此之外，還可以利用細胞凍存的形式來購買、寄贈、交換和運送某些細胞。
操作步驟：
1. 細胞達到90%匯合度，吸掉原有培養基，PBS清洗一次。
2. 加入細胞消化液使之完全覆蓋皿/瓶底，室溫孵育4-5min或37℃孵育2-4min分鐘，顯微鏡下觀察大部分細胞脫離皿底即停止消化。
3. 加入消化液2倍體積的人間充質干細胞培養基，用移液槍輕輕吹打瓶壁上未完全脫離的細胞，并輕輕吹打混勻，使細胞完全分散。
4. 將細胞懸液轉移到15mL離心管中，1200rpm離心3min，吸掉上清。
5. 加入適量無血清細胞凍存液（推薦產品：埃澤思無血清細胞凍存液（治療級） AC-1001006），調整細胞凍存密度在1×106cells/mL左右，每支凍存管分裝1.5-2ml。
6. 直接放入-80℃，24h后轉入液氮中長期保存。
注意細節：
1. 細胞如果是第一次養，建議至少凍存兩個批次以上，以盡量避免因為凍存問題導致細胞絕種；
2. 如果沒有程序降溫盒，可以將凍存細胞依次放于4℃1h，-20℃2h，-80℃過夜，大部分細胞也可以適應，但原代細胞不建議這么處理。
主營項目
1. 動物實驗
動物飼養、疾病造模、行為學檢測、心功能、無創血壓、血常規、全自動生化檢測等
2. 細胞實驗
CCK8/MTT、原代細胞分離、流式細胞實驗、細胞劃痕、侵襲、遷移、EDU染色、轉染、穩定株
3. 分子生物學
PCR檢測、熒光定量PCR、絕對定量PCR、端粒酶長度、pull down、雙熒光素酶、SSR、SNP檢測等
4. 蛋白實驗
WB、Co-IP、酵母雙雜
5. 病理實驗
HE染色、免疫組學、電鏡
6. 生理生化實驗
肝腎功能、抗氧化、免疫反應等生理免疫指標;動植物營養指標、微量元素、重金屬、酶活等。
7. 多組學實驗
基因組、轉錄調控、蛋白組、代謝組、微生物多樣性、宏基因組、生信分析
8. 整體課題實驗
方案設計、整體實驗交付、標書寫作、論文潤色、協助投稿
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