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干貨分享丨細胞培養(yǎng)簡單攻略-復(fù)蘇/傳代/凍存

瀏覽：126 發(fā)表時間：2025-07-24

細胞培養(yǎng)是指將細胞從動物或植物體內(nèi)取出，然后在適宜的人工環(huán)境中生長的過程。細胞可以在培養(yǎng)前直接從組織中取出并通過酶或機械方法進行解離，也可以來源于已建立的細胞系或細胞株。

細胞培養(yǎng)又具體分為細胞傳代、換液、凍存、復(fù)蘇等一系列過程，每個步驟都對應(yīng)著不同的操作技術(shù)要點，想要養(yǎng)好細胞，每一步都必須掌握。

1. 細胞復(fù)蘇

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細胞復(fù)蘇是指將休眠的細胞重新活化，使之重新生長，分裂產(chǎn)生子細胞的過程。復(fù)蘇后的細胞可重新進入細胞周期，獲得細胞類型特異的生物學(xué)功能。復(fù)蘇細胞一般采用快速融化法，以保證細胞外結(jié)晶快速融化，避免慢速融化產(chǎn)生的水分滲入細胞內(nèi)，再次形成胞內(nèi)結(jié)晶損傷細胞。

操作步驟：

1. 從液氮中取出凍存的細胞，迅速將凍存管放入37℃水浴快速融解。

2. 在生物安全柜或超凈臺中，將解凍后的細胞懸液緩慢加入5mL預(yù)溫的細胞培養(yǎng)基（推薦產(chǎn)品：埃澤思人間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基 AC-1001003）。

3. 1200rpm 離心3min，吸掉上清，加入10mL培養(yǎng)基重懸細胞。

4. 將細胞均勻鋪到培養(yǎng)皿中，水平十字振動培養(yǎng)皿使細胞均勻分布，5% CO2的 37℃恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時后觀察細胞狀態(tài)。

5. 24h后更換新鮮細胞培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每2-3天更換培養(yǎng)液。

注意細節(jié)：

1. 從液氮罐中拿出凍存管時要做好防護工作，需配備防凍手套和護目鏡；

2. 水浴鍋溫度：嚴格控制在37℃，且解凍時凍存管管口切勿浸沒到水中；

3. 復(fù)蘇接種密度：一管細胞（1×106個）接種到1個T25（底面積25cm2）中，搖勻后置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2. 細胞傳代培養(yǎng)

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傳代培養(yǎng)中的細胞傳代培養(yǎng)，當(dāng)原代培養(yǎng)成功以后，隨著培養(yǎng)時間的延長和細胞不斷分裂，一則細胞之間相互接觸而發(fā)生接觸性抑制，生長速度減慢甚至停止另一方面也會因營養(yǎng)物不足和代謝物積累而不利于生長或發(fā)生中毒。此時就需要將培養(yǎng)物分割成小的部分，重新接種到另外的培養(yǎng)器皿(瓶)內(nèi)，再進行培養(yǎng)。這個過程就稱為傳代或者再培養(yǎng)。對單層培養(yǎng)而言，80%匯合或剛匯合的細胞是較理想的傳代階段。

操作步驟：

1. 在顯微鏡下觀察細胞，當(dāng)細胞融合度達到 90%，即可傳代。

2. 在超凈臺/安全柜中，吸掉原有培養(yǎng)基，加入PBS 溶液清洗一次，加入細胞消化液（

推薦產(chǎn)品：埃澤思細胞消化液 AC-1001024）使之完全覆蓋皿/瓶底。

3. 室溫孵育4-5分鐘或37℃孵育2-4分鐘，顯微鏡下觀察大部分細胞脫離皿底即停止消化。

4. 加入消化液2倍體積的人間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基，用移液器輕輕吹打瓶壁上未完全脫離的細胞，并輕輕吹打混勻，使細胞完全分散。

5. 將細胞懸液轉(zhuǎn)移到15mL離心管中，1200rpm離心3min。

6. 棄上清，加入人間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基，重懸細胞，計數(shù)。1:3-1:4比例傳代，或按1-2x

104cells/c㎡傳代，均勻鋪在培養(yǎng)皿/瓶中，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

注意細節(jié)：

1. 細胞傳代所需的時間:2-4天。5代及之前的細胞，生長速度較快。5 代以后的細胞，生長速度稍緩；

2. 消化時間需要同時考慮到細胞本身特性，細胞密度，胰酶濃度等多方面因素，靈活調(diào)整，切忌生搬硬套；

3. 傳代過程中加入任何試劑都應(yīng)該輕柔緩慢的加到皿壁，切忌直接加到細胞面上，如果細胞本身貼壁能力較差，可能導(dǎo)致細胞凋亡。

3. 細胞凍存

細胞凍存是細胞保存的主要方法之一。利用凍存技術(shù)將細胞置于-196℃液氮中低溫保存，可以使細胞暫時脫離生長狀態(tài)而將其細胞特性保存起來，這樣在需要的時候再復(fù)蘇細胞用于實驗。而且適度地保存一定量的細胞，可以防止因正在培養(yǎng)的細胞被污染或其他意外事件而使細胞丟種，起到了細胞保種的作用。除此之外，還可以利用細胞凍存的形式來購買、寄贈、交換和運送某些細胞。

操作步驟：

1. 細胞達到90%匯合度，吸掉原有培養(yǎng)基，PBS清洗一次。

2. 加入細胞消化液使之完全覆蓋皿/瓶底，室溫孵育4-5min或37℃孵育2-4min分鐘，顯微鏡下觀察大部分細胞脫離皿底即停止消化。

3. 加入消化液2倍體積的人間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基，用移液槍輕輕吹打瓶壁上未完全脫離的細胞，并輕輕吹打混勻，使細胞完全分散。

4. 將細胞懸液轉(zhuǎn)移到15mL離心管中，1200rpm離心3min，吸掉上清。

5. 加入適量無血清細胞凍存液（推薦產(chǎn)品：埃澤思無血清細胞凍存液（治療級） AC-1001006），調(diào)整細胞凍存密度在1×106cells/mL左右，每支凍存管分裝1.5-2ml。

6. 直接放入-80℃，24h后轉(zhuǎn)入液氮中長期保存。

注意細節(jié)：

1. 細胞如果是第一次養(yǎng)，建議至少凍存兩個批次以上，以盡量避免因為凍存問題導(dǎo)致細胞絕種；

2. 如果沒有程序降溫盒，可以將凍存細胞依次放于4℃1h，-20℃2h，-80℃過夜，大部分細胞也可以適應(yīng)，但原代細胞不建議這么處理。

主營項目

1. 動物實驗