細胞如何“愈合”？一文詳解細胞劃痕實驗全過程
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發表時間：2025-07-30
今天聊下細胞劃痕實驗的操作及分析步驟，細胞劃痕實驗（Cell scratch assay），也被稱作傷口愈合實驗（Wound healing assay），是一種模擬體內傷口愈合過程的體外實驗技術。這項技術通過在細胞單層上制造一個“劃痕”或“傷口”，并記錄細胞如何填補這一空白區域，來研究細胞的遷移行為、修復能力以及細胞間的相互作用。感興趣的小伙伴可以留言交流，加V回復更快！
實驗步驟：
1 先用marker筆在6孔板背后，用直尺比著均勻的劃橫線，間隔大約0.5-1cm，橫穿過孔，每孔至少穿過5條線；
2 消化細胞，終止，制備細胞懸液，調整細胞懸液密度，6孔板每孔鋪5×105左右各細胞，因為不同細胞的大小以及增殖速度有所不同，故每孔鋪的細胞量也有所不同，以第二天劃痕之前，細胞能夠均一的鋪板6孔板底為宜；
3 第二天，用200μL的黃色槍頭，垂直于6孔板底部的橫線進行劃痕，槍頭垂直，不要傾斜，最好使用同一槍頭進行劃痕；
4 用PBS洗滌3次，去除脫落的細胞，加入PBS時動作盡量輕柔，防止將其他貼壁細胞吹起，加入無血清或低血清培養基（若實驗方案中提及需要用藥物刺激，則根據實驗方案進行相應的藥物刺激），放入37℃，5% CO2培養箱中進行培養，根據實驗方案中提供的觀察時間進行觀察、拍照（在劃痕時會與6孔板底部形成若干交叉點，可將其作為固定的觀察點，即可解決觀察拍照時，前后位置不統一的情況）；
5 統計分析：使用Image J軟件打開圖片后，隨機劃取6-8條水平線，計算細胞間距離的平均值；每個時間點細胞整體遷移的距離=每個時間點的距離長度－0h的距離。
6 統計分析詳細步驟：
a. 首先，打開Image J，File--Open選擇要分析的圖片,然后 image里面的Type,選擇8-bit。
b . image--adjust--threshold--調到B&W--背景為白色，劃痕面積為黑色--apply。
c .Anayze--Measure
e . 導出統計結果，每個時間點細胞整體遷移的距離=每個時間點的距離長度－0h的距離，分析。
注意事項：
1 輔助劃線：在實驗開始前，使用輔助線幫助確保劃痕的直線性，這有助于后續的圖像分析。重要的是，在拍照前要清除這些輔助線，以免影響結果。
2 細胞接種量：根據細胞的生長特性和速度來確定接種量，目標是在培養過夜后細胞能夠完全融合，形成無空隙的單層。不均勻的細胞層可能會干擾圖像分析和實驗結論。
3 一致性劃痕：在不同孔中制造劃痕時，建議使用同一槍頭以減少變異。在劃痕過程中，確保槍頭與細胞層垂直對齊，并可參照直尺或孔板蓋來保持力度一致，以確保劃痕的一致性。
4 輕柔沖洗：在沖洗細胞時，動作要輕柔，避免對細胞層造成破壞。使用貼壁的方式加入緩沖液，并多次重復以徹底清除細胞碎片。
5 控制細胞增殖：為避免細胞增殖對遷移結果的影響，可以采取以下措施：
使用無血清或低血清培養基（低于2%）來降低細胞增殖。
選擇在細胞周期內（如6、12、24小時）的合適時間點進行觀察，避免超過細胞的一個生命周期。
如果研究重點僅在于細胞遷移，可以考慮使用絲裂霉素（1μg/ml）預處理1小時以抑制細胞分裂。
6 劃痕寬度的一致性：確保所有劃痕的寬度一致是實驗成功的關鍵。手工使用槍頭制造劃痕可能難以保證寬度的一致性，這可能影響實驗結果。有條件的情況下，推薦使用特定的培養設備，如culture Insert，它允許在移除Insert后產生固定寬度的劃痕，從而簡化實驗過程并提高結果的可重復性。
經過上述詳細的步驟解析，相信您對細胞劃痕實驗的每一個細節都有了深刻的理解。如果您覺得本文對您或您的同事、朋友有幫助，請不要猶豫，點擊收藏或轉發，讓更多人受益于這些寶貴的知識。科學的進步需要我們共同的努力和分享。每一次實驗都可能是通往新發現的大門。關注我們的公眾號，與我們一同科研，歡迎小伙伴分享自己的實驗經驗。感謝您耐心閱讀到最后，您的支持是我們不斷前行的動力。期待在下一次的分享中，我們能為您帶來更多的科學知識和實驗技巧。
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