細(xì)胞轉(zhuǎn)染與實(shí)驗(yàn)常見問題解決方法
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發(fā)表時間：2025-08-04
在進(jìn)行基因的功能研究時，主要策略有兩個，一個是過表達(dá)，一個是做敲除或做干擾。在此過程中，細(xì)胞轉(zhuǎn)染是很常規(guī)的操作，但是有時會遇到轉(zhuǎn)染效率低，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)無法推進(jìn)。今天我們分享下細(xì)胞轉(zhuǎn)染過程的幾個注意事項(xiàng)。
1. 關(guān)于啟動子的選擇。 啟動子對于細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率有很大的影響。通常情況下，過表達(dá)質(zhì)粒選擇廣譜強(qiáng)啟動子CMV，干擾質(zhì)粒選擇U6或H1作為啟動子（見下圖）。在特殊情況下，對于特異性細(xì)胞的轉(zhuǎn)染或感染，需要考慮用特異啟動子，比如心肌細(xì)胞特異啟動子cTNT，肝臟特異啟動子TBG，神經(jīng)特異啟動子hsyn。啟動子的選擇對轉(zhuǎn)染過程本身影響不大，但是對轉(zhuǎn)染效率有很大的影響。
2. 質(zhì)粒大小與質(zhì)量。超螺旋結(jié)構(gòu)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率比線性質(zhì)粒高得多，特別是瞬時轉(zhuǎn)染；但線性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的整合幾率高。質(zhì)粒越大，轉(zhuǎn)染效率相應(yīng)會降低。此外，質(zhì)粒濃度及純度也會影響轉(zhuǎn)染效率。OD260/280在1.8~2.0，是一個基本的指標(biāo)，即沒有蛋白和RNA 污染。最重要的是內(nèi)毒素要清除干凈。內(nèi)毒素清除的效果，才是是否用于轉(zhuǎn)染的決定指標(biāo)。純化質(zhì)粒的質(zhì)量也會影響轉(zhuǎn)染效率，盡量要選擇高質(zhì)量的質(zhì)粒。
3. 轉(zhuǎn)染試劑。在確定質(zhì)粒和細(xì)胞之后，就要考慮轉(zhuǎn)染試劑的選擇了。轉(zhuǎn)染試劑種類很多，如磷酸鹽、脂質(zhì)體和陽性聚合物等，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，如lip系列。針對一般細(xì)胞系，上述轉(zhuǎn)染試劑的轉(zhuǎn)染效率還行，但是針對一些難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，如免疫細(xì)胞，懸浮細(xì)胞以及原代細(xì)胞，這些對轉(zhuǎn)染試劑有比較高的要求，很多公司推出了新的轉(zhuǎn)染試劑，如HighGene，PolyJet等等。如果以上方式不奏效，還可以考慮電轉(zhuǎn)。
4. 對于難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，還可以通過慢病毒包裝和感染的方式來實(shí)現(xiàn)。制備慢病毒穿梭質(zhì)粒及輔助包裝質(zhì)粒，用無內(nèi)毒素的試劑盒抽提，共轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后 18小時后更換為完全培養(yǎng)基，培養(yǎng) 48 小時后，收集富含慢病毒顆粒的細(xì)胞上清液，然后感染靶細(xì)胞。
一、轉(zhuǎn)染試劑毒性問題
1. 原因
轉(zhuǎn)染試劑本身可能對細(xì)胞有毒性。不同細(xì)胞系對轉(zhuǎn)染試劑的耐受性不同，有些轉(zhuǎn)染試劑可能會破壞細(xì)胞膜的完整性，影響細(xì)胞的正常生理功能。例如，陽離子脂質(zhì)體類轉(zhuǎn)染試劑，其帶正電荷的脂質(zhì)成分可能會與細(xì)胞膜上的負(fù)電荷成分過度相互作用，導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷。
轉(zhuǎn)染試劑的濃度過高是常見的導(dǎo)致細(xì)胞毒性的因素。如果按照不恰當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)方案使用過量的轉(zhuǎn)染試劑，會使細(xì)胞受到化學(xué)損傷，表現(xiàn)為細(xì)胞變圓、脫落、死亡等現(xiàn)象。
2. 解決方法
優(yōu)化轉(zhuǎn)染試劑的選擇。在實(shí)驗(yàn)前，可以查閱相關(guān)文獻(xiàn)，了解不同細(xì)胞系適用的轉(zhuǎn)染試劑類型。對于一些比較敏感的細(xì)胞系，如原代細(xì)胞，可嘗試使用低毒性的轉(zhuǎn)染試劑，如病毒載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)或者非脂質(zhì)體類的轉(zhuǎn)染試劑。
優(yōu)化轉(zhuǎn)染試劑的濃度。進(jìn)行濃度梯度實(shí)驗(yàn)，一般從較低濃度開始嘗試，觀察細(xì)胞在不同濃度轉(zhuǎn)染試劑下的狀態(tài)。確定一個既能保證轉(zhuǎn)染效率又能使細(xì)胞毒性最小的最佳濃度。例如，在使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑時，可以設(shè)置一系列濃度，如 1 - 5μL/mL 培養(yǎng)基，通過檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的活性（如使用 MTT 法）和轉(zhuǎn)染效率（如檢測報告基因的表達(dá)）來確定最適濃度。
二、DNA質(zhì)量及用量問題
1. 原因
DNA 純度不夠會影響細(xì)胞狀態(tài)。如果 DNA 樣品中含有內(nèi)毒素、蛋白質(zhì)或其他雜質(zhì)，可能會引發(fā)細(xì)胞的免疫反應(yīng)或毒性作用。例如，內(nèi)毒素可以激活細(xì)胞內(nèi)的炎癥信號通路，導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，出現(xiàn)生長遲緩、凋亡等情況。
過高的 DNA 用量也會對細(xì)胞產(chǎn)生不良影響。過多的外源性 DNA 進(jìn)入細(xì)胞后，可能會干擾細(xì)胞內(nèi)的正常基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制，導(dǎo)致細(xì)胞代謝紊亂。同時，大量的 DNA 可能會形成難以溶解的復(fù)合物，對細(xì)胞造成物理損傷。
2. 解決方法
確保 DNA 的純度。使用高質(zhì)量的 DNA 提取試劑盒，并在提取后進(jìn)行純化處理，如通過柱層析或乙醇沉淀等方法去除內(nèi)毒素和其他雜質(zhì)。可以使用內(nèi)毒素檢測試劑盒檢測 DNA 樣品中的內(nèi)毒素含量，一般要求內(nèi)毒素水平低于 0.1 EU/μg DNA。
優(yōu)化 DNA 用量。通過預(yù)實(shí)驗(yàn)來確定合適的 DNA 用量。對于大多數(shù)細(xì)胞系，轉(zhuǎn)染的 DNA 量通常在 0.1 - 10μg 之間。在保證轉(zhuǎn)染效果的前提下，盡量減少 DNA 的用量。例如，在轉(zhuǎn)染某種哺乳動物細(xì)胞系時，從 0.1μg 開始逐步增加 DNA 用量，同時觀察細(xì)胞狀態(tài)和轉(zhuǎn)染效率，找到最佳的 DNA 用量范圍。
三、細(xì)胞本身的因素
1. 原因
細(xì)胞的生長狀態(tài)對轉(zhuǎn)染后的存活和功能至關(guān)重要。如果細(xì)胞在轉(zhuǎn)染前生長不健康，如處于對數(shù)生長期晚期或已經(jīng)過度匯合，細(xì)胞的生理功能可能已經(jīng)受到影響，對轉(zhuǎn)染過程的耐受性會降低。此時細(xì)胞的細(xì)胞膜流動性可能下降，內(nèi)吞作用等與轉(zhuǎn)染相關(guān)的細(xì)胞機(jī)制也會受到干擾。
不同的細(xì)胞系對轉(zhuǎn)染的敏感性差異很大。有些細(xì)胞系，如 HEK293 細(xì)胞，相對容易轉(zhuǎn)染且對轉(zhuǎn)染過程的耐受性較好；而原代細(xì)胞等則比較敏感，容易在轉(zhuǎn)染后出現(xiàn)狀態(tài)不佳的情況。這是因?yàn)樵?xì)胞的生理特性與永生化細(xì)胞系不同，它們保留了更多原始組織的特性，對環(huán)境變化更為敏感。
2. 解決方法
確保細(xì)胞在轉(zhuǎn)染前處于良好的生長狀態(tài)。一般選擇處于對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，此時細(xì)胞的活力和增殖能力最強(qiáng)。對于貼壁細(xì)胞，轉(zhuǎn)染時的匯合度也很重要，通常保持在 70 - 80% 左右的匯合度較為合適。可以通過定期觀察細(xì)胞形態(tài)、計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量和檢測細(xì)胞活性（如臺盼藍(lán)染色法）來監(jiān)控細(xì)胞狀態(tài)。
根據(jù)細(xì)胞系的特點(diǎn)調(diào)整轉(zhuǎn)染策略。對于敏感的細(xì)胞系，采用更溫和的轉(zhuǎn)染方法。例如，對于原代神經(jīng)元細(xì)胞，可以使用電穿孔轉(zhuǎn)染法，并優(yōu)化電穿孔參數(shù)（如電壓、脈沖時間等）以減少對細(xì)胞的損傷。同時，可以在轉(zhuǎn)染后提供更適宜的培養(yǎng)條件，如添加神經(jīng)營養(yǎng)因子等促進(jìn)細(xì)胞恢復(fù)。
四、轉(zhuǎn)染條件問題
1. 原因
轉(zhuǎn)染的時間過長可能會對細(xì)胞產(chǎn)生負(fù)面影響。例如，在一些基于脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染過程中，如果脂質(zhì)體 - DNA 復(fù)合物與細(xì)胞的孵育時間過長，細(xì)胞可能會過度攝取復(fù)合物，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的代謝負(fù)擔(dān)過重。
轉(zhuǎn)染過程中的溫度和二氧化碳濃度等環(huán)境因素也會影響細(xì)胞狀態(tài)。不合適的溫度會影響細(xì)胞的代謝速率和細(xì)胞膜的流動性，進(jìn)而影響轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞健康。例如，溫度過高可能會加速細(xì)胞的代謝，使細(xì)胞內(nèi)的酶活性異常，導(dǎo)致細(xì)胞應(yīng)激；溫度過低則可能會抑制細(xì)胞的內(nèi)吞作用等轉(zhuǎn)染相關(guān)機(jī)制。
2. 解決方法
優(yōu)化轉(zhuǎn)染時間。通過預(yù)實(shí)驗(yàn)來確定最佳的轉(zhuǎn)染時間。一般來說，脂質(zhì)體 - DNA 復(fù)合物與細(xì)胞的孵育時間在 2 - 6 小時之間。在孵育結(jié)束后，及時更換新鮮的培養(yǎng)基，以去除未被攝取的復(fù)合物和減少潛在的毒性物質(zhì)。
嚴(yán)格控制轉(zhuǎn)染環(huán)境條件。將細(xì)胞培養(yǎng)箱的溫度和二氧化碳濃度設(shè)置在合適的范圍內(nèi)，通常溫度為 37°C，二氧化碳濃度為 5%。可以使用溫度和二氧化碳濃度監(jiān)測設(shè)備來確保培養(yǎng)箱內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定性。
溫馨提示 | 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)在生命科學(xué)研究中扮演著重要的角色，它們幫助我們理解細(xì)胞的功能和相互作用，揭示疾病的機(jī)制，評估藥物的效果。如果您科研實(shí)驗(yàn)中想要進(jìn)行細(xì)胞功能相關(guān)檢測，但您正趕上時間緊任務(wù)重，沒有時間做這部分實(shí)驗(yàn)，那不妨找康旭禾生物聊聊吧~康旭禾可為您提供全方位、定制化服務(wù)！
主營項(xiàng)目
1. 動物實(shí)驗(yàn)
動物飼養(yǎng)、疾病造模、行為學(xué)檢測、心功能、無創(chuàng)血壓、血常規(guī)、全自動生化檢測等
2. 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)
CCK8/MTT、原代細(xì)胞分離、流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕、侵襲、遷移、EDU染色、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定株
3. 分子生物學(xué)
PCR檢測、熒光定量PCR、絕對定量PCR、端粒酶長度、pull down、雙熒光素酶、SSR、SNP檢測等
4. 蛋白實(shí)驗(yàn)
WB、Co-IP、酵母雙雜
5. 病理實(shí)驗(yàn)
HE染色、免疫組學(xué)、電鏡
6. 生理生化實(shí)驗(yàn)
肝腎功能、抗氧化、免疫反應(yīng)等生理免疫指標(biāo);動植物營養(yǎng)指標(biāo)、微量元素、重金屬、酶活等。
7. 多組學(xué)實(shí)驗(yàn)
基因組、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白組、代謝組、微生物多樣性、宏基因組、生信分析
8. 整體課題實(shí)驗(yàn)
方案設(shè)計(jì)、整體實(shí)驗(yàn)交付、標(biāo)書寫作、論文潤色、協(xié)助投稿
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