細胞轉染與實驗常見問題解決方法
瀏覽：105
發表時間：2025-08-04
在進行基因的功能研究時，主要策略有兩個，一個是過表達，一個是做敲除或做干擾。在此過程中，細胞轉染是很常規的操作，但是有時會遇到轉染效率低，導致實驗無法推進。今天我們分享下細胞轉染過程的幾個注意事項。
1. 關于啟動子的選擇。 啟動子對于細胞轉染效率有很大的影響。通常情況下，過表達質粒選擇廣譜強啟動子CMV，干擾質粒選擇U6或H1作為啟動子（見下圖）。在特殊情況下，對于特異性細胞的轉染或感染，需要考慮用特異啟動子，比如心肌細胞特異啟動子cTNT，肝臟特異啟動子TBG，神經特異啟動子hsyn。啟動子的選擇對轉染過程本身影響不大，但是對轉染效率有很大的影響。
2. 質粒大小與質量。超螺旋結構質粒的轉染效率比線性質粒高得多，特別是瞬時轉染；但線性質粒轉染的整合幾率高。質粒越大，轉染效率相應會降低。此外，質粒濃度及純度也會影響轉染效率。OD260/280在1.8~2.0，是一個基本的指標，即沒有蛋白和RNA 污染。最重要的是內毒素要清除干凈。內毒素清除的效果，才是是否用于轉染的決定指標。純化質粒的質量也會影響轉染效率，盡量要選擇高質量的質粒。
3. 轉染試劑。在確定質粒和細胞之后，就要考慮轉染試劑的選擇了。轉染試劑種類很多，如磷酸鹽、脂質體和陽性聚合物等，脂質體轉染試劑，如lip系列。針對一般細胞系，上述轉染試劑的轉染效率還行，但是針對一些難轉染的細胞，如免疫細胞，懸浮細胞以及原代細胞，這些對轉染試劑有比較高的要求，很多公司推出了新的轉染試劑，如HighGene，PolyJet等等。如果以上方式不奏效，還可以考慮電轉。
4. 對于難以轉染的細胞，還可以通過慢病毒包裝和感染的方式來實現。制備慢病毒穿梭質粒及輔助包裝質粒，用無內毒素的試劑盒抽提，共轉染 293T 細胞，轉染后 18小時后更換為完全培養基，培養 48 小時后，收集富含慢病毒顆粒的細胞上清液，然后感染靶細胞。
一、轉染試劑毒性問題
1. 原因
轉染試劑本身可能對細胞有毒性。不同細胞系對轉染試劑的耐受性不同，有些轉染試劑可能會破壞細胞膜的完整性，影響細胞的正常生理功能。例如，陽離子脂質體類轉染試劑，其帶正電荷的脂質成分可能會與細胞膜上的負電荷成分過度相互作用，導致細胞膜損傷。
轉染試劑的濃度過高是常見的導致細胞毒性的因素。如果按照不恰當的實驗方案使用過量的轉染試劑，會使細胞受到化學損傷，表現為細胞變圓、脫落、死亡等現象。
2. 解決方法
優化轉染試劑的選擇。在實驗前，可以查閱相關文獻，了解不同細胞系適用的轉染試劑類型。對于一些比較敏感的細胞系，如原代細胞，可嘗試使用低毒性的轉染試劑，如病毒載體介導的轉染系統或者非脂質體類的轉染試劑。
優化轉染試劑的濃度。進行濃度梯度實驗，一般從較低濃度開始嘗試，觀察細胞在不同濃度轉染試劑下的狀態。確定一個既能保證轉染效率又能使細胞毒性最小的最佳濃度。例如，在使用脂質體轉染試劑時，可以設置一系列濃度，如 1 - 5μL/mL 培養基，通過檢測轉染后細胞的活性（如使用 MTT 法）和轉染效率（如檢測報告基因的表達）來確定最適濃度。
二、DNA質量及用量問題
1. 原因
DNA 純度不夠會影響細胞狀態。如果 DNA 樣品中含有內毒素、蛋白質或其他雜質，可能會引發細胞的免疫反應或毒性作用。例如，內毒素可以激活細胞內的炎癥信號通路，導致細胞產生應激反應，出現生長遲緩、凋亡等情況。
過高的 DNA 用量也會對細胞產生不良影響。過多的外源性 DNA 進入細胞后，可能會干擾細胞內的正常基因表達調控機制，導致細胞代謝紊亂。同時，大量的 DNA 可能會形成難以溶解的復合物，對細胞造成物理損傷。
2. 解決方法
確保 DNA 的純度。使用高質量的 DNA 提取試劑盒，并在提取后進行純化處理，如通過柱層析或乙醇沉淀等方法去除內毒素和其他雜質。可以使用內毒素檢測試劑盒檢測 DNA 樣品中的內毒素含量，一般要求內毒素水平低于 0.1 EU/μg DNA。
優化 DNA 用量。通過預實驗來確定合適的 DNA 用量。對于大多數細胞系，轉染的 DNA 量通常在 0.1 - 10μg 之間。在保證轉染效果的前提下，盡量減少 DNA 的用量。例如，在轉染某種哺乳動物細胞系時，從 0.1μg 開始逐步增加 DNA 用量，同時觀察細胞狀態和轉染效率，找到最佳的 DNA 用量范圍。
三、細胞本身的因素
1. 原因
細胞的生長狀態對轉染后的存活和功能至關重要。如果細胞在轉染前生長不健康，如處于對數生長期晚期或已經過度匯合，細胞的生理功能可能已經受到影響，對轉染過程的耐受性會降低。此時細胞的細胞膜流動性可能下降，內吞作用等與轉染相關的細胞機制也會受到干擾。
不同的細胞系對轉染的敏感性差異很大。有些細胞系，如 HEK293 細胞，相對容易轉染且對轉染過程的耐受性較好；而原代細胞等則比較敏感，容易在轉染后出現狀態不佳的情況。這是因為原代細胞的生理特性與永生化細胞系不同，它們保留了更多原始組織的特性，對環境變化更為敏感。
2. 解決方法
確保細胞在轉染前處于良好的生長狀態。一般選擇處于對數生長期的細胞進行轉染，此時細胞的活力和增殖能力最強。對于貼壁細胞，轉染時的匯合度也很重要，通常保持在 70 - 80% 左右的匯合度較為合適。可以通過定期觀察細胞形態、計數細胞數量和檢測細胞活性（如臺盼藍染色法）來監控細胞狀態。
根據細胞系的特點調整轉染策略。對于敏感的細胞系，采用更溫和的轉染方法。例如，對于原代神經元細胞，可以使用電穿孔轉染法，并優化電穿孔參數（如電壓、脈沖時間等）以減少對細胞的損傷。同時，可以在轉染后提供更適宜的培養條件，如添加神經營養因子等促進細胞恢復。
四、轉染條件問題
1. 原因
轉染的時間過長可能會對細胞產生負面影響。例如，在一些基于脂質體的轉染過程中，如果脂質體 - DNA 復合物與細胞的孵育時間過長，細胞可能會過度攝取復合物，導致細胞內的代謝負擔過重。
轉染過程中的溫度和二氧化碳濃度等環境因素也會影響細胞狀態。不合適的溫度會影響細胞的代謝速率和細胞膜的流動性，進而影響轉染效率和細胞健康。例如，溫度過高可能會加速細胞的代謝，使細胞內的酶活性異常，導致細胞應激；溫度過低則可能會抑制細胞的內吞作用等轉染相關機制。
2. 解決方法
優化轉染時間。通過預實驗來確定最佳的轉染時間。一般來說，脂質體 - DNA 復合物與細胞的孵育時間在 2 - 6 小時之間。在孵育結束后，及時更換新鮮的培養基，以去除未被攝取的復合物和減少潛在的毒性物質。
嚴格控制轉染環境條件。將細胞培養箱的溫度和二氧化碳濃度設置在合適的范圍內，通常溫度為 37°C，二氧化碳濃度為 5%。可以使用溫度和二氧化碳濃度監測設備來確保培養箱內環境的穩定性。
溫馨提示 | 細胞實驗在生命科學研究中扮演著重要的角色，它們幫助我們理解細胞的功能和相互作用，揭示疾病的機制，評估藥物的效果。如果您科研實驗中想要進行細胞功能相關檢測，但您正趕上時間緊任務重，沒有時間做這部分實驗，那不妨找康旭禾生物聊聊吧~康旭禾可為您提供全方位、定制化服務！
主營項目
1. 動物實驗
動物飼養、疾病造模、行為學檢測、心功能、無創血壓、血常規、全自動生化檢測等
2. 細胞實驗
CCK8/MTT、原代細胞分離、流式細胞實驗、細胞劃痕、侵襲、遷移、EDU染色、轉染、穩定株
3. 分子生物學
PCR檢測、熒光定量PCR、絕對定量PCR、端粒酶長度、pull down、雙熒光素酶、SSR、SNP檢測等
4. 蛋白實驗
WB、Co-IP、酵母雙雜
5. 病理實驗
HE染色、免疫組學、電鏡
6. 生理生化實驗
肝腎功能、抗氧化、免疫反應等生理免疫指標;動植物營養指標、微量元素、重金屬、酶活等。
7. 多組學實驗
基因組、轉錄調控、蛋白組、代謝組、微生物多樣性、宏基因組、生信分析
8. 整體課題實驗
方案設計、整體實驗交付、標書寫作、論文潤色、協助投稿
聯系我們
康旭禾生物提供包括動物實驗、細胞實驗、分子實驗、病理實驗、流式檢測實驗及論文翻譯、潤色、投稿輔助等相關的各項服務。
聯系方式：15579126092
公司官網：http://consurebio.com/
公司地址：江西省南昌市南昌縣小藍VR產業基地D座2樓
點擊右上角
分享給朋友吧
長按圖片保存/分享
105
在線咨詢
