科研干貨！CCK8實驗大總結：應用領域、實驗原理、實驗流程及操作要點
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發表時間：2025-08-05
ell Counting Kit-8（簡稱CCK8）是一種基于WST-8的廣泛應用于細胞增殖和細胞毒性的檢測試劑。
WST-8【化學名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】，是一種類似于MTT的化合物，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）存在的情況下，被線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的橙黃色甲瓚產物（formazan）。
細胞增殖越多越快，顏色越深；細胞毒性越大，則顏色越淺，對于同樣的細胞，顏色的深淺與活細胞的數量成正比，因此可利用這一特性直接進行細胞增殖和毒性分析。
No.1
應用領域
CCK8（Cell Counting Kit-8）實驗作為一種高效、便捷的細胞活性檢測方法，在多個領域發揮著關鍵作用。
在藥物研發領域，CCK8 實驗是評估藥物對細胞增殖、毒性影響的重要手段。科研人員通過向培養的細胞中加入不同濃度的藥物，利用 CCK8 檢測細胞活性變化，篩選具有潛在治療效果的藥物，同時評估藥物的安全性和毒性。例如，在抗癌藥物研發中，通過 CCK8 實驗可以判斷藥物對腫瘤細胞的抑制效果，為后續臨床試驗提供數據支持。
在細胞生物學研究中，CCK8 實驗常用于研究細胞的生長特性、增殖能力以及細胞周期調控機制。通過對不同處理條件下細胞活性的檢測，探究細胞在各種因素影響下的生長變化。比如，研究細胞因子對細胞增殖的促進作用，或是外界環境因素（如溫度、酸堿度）對細胞活性的影響。
此外，在毒理學研究中，CCK8 實驗可用于檢測化學物質、重金屬等對細胞的毒性作用，評估環境污染物對生物體細胞的潛在危害，為環境保護和職業健康提供科學依據。在干細胞研究領域，CCK8 實驗能夠監測干細胞的增殖能力和分化過程中的活性變化，有助于優化干細胞培養和分化條件。
No.2
實驗原理
CCK8 實驗的原理基于細胞內線粒體中的脫氫酶?；罴毎麅染€粒體中的脫氫酶能夠將 CCK8 試劑中的 WST-8（化學名：2-(2 - 甲氧基 - 4 - 硝基苯基)-3-(4 - 硝基苯基)-5-(2,4 - 二磺酸苯)-2H - 四唑單鈉鹽）還原為具有高度水溶性的黃色甲臜產物（Formazan）。
產生的甲臜量與活細胞數量呈正相關，細胞活性越高，線粒體脫氫酶活性越強，生成的甲臜就越多。
通過酶標儀在 450nm 波長處測定吸光度值（OD 值），根據標準曲線或直接比較 OD 值，即可準確反映細胞的活性和數量 。
No.3
實驗步驟
一、鋪板
1. 對前一天培養好的細胞消化、離心、計數。
2. 在96孔板上接種100μL 3000-7000/孔的細胞，在37℃、5% CO2、90%濕度條件下繼續培養12-24 h。
注意：
具體的細胞數量會根據細胞的大小和增殖速度而定。每個實驗組需設置3-5個復合孔。
因最外圈會出現邊緣效應（邊緣孔的濕度較中間孔低，水分揮發的現象更為嚴重），96孔板最外圈不做任何處理加入200μL PBS或細胞培養液。
細胞鋪板時，一定要邊混勻細胞邊鋪板，最好用排槍鋪板，減少鋪板所用時間，鋪板后立即觀察鋪板密度是否均勻，如果不均勻則標記出密度不均勻孔，棄去該孔。
二、給藥
按照梯度進行細胞給藥處理，通常每組至少設置3個復孔，給藥梯度一般為倍數稀釋，可設置2或5梯度，給藥結束后細胞放入細胞培養箱內繼續孵育。
注意：
給藥方法因人而異，可以吸去原有培養基再給藥，也可以不棄去原有培養基，直接100μL+100μL給藥，但此時需要注意濃度配成終濃度的2倍。
三、結果檢測
貼壁細胞：吸棄原細胞培養液，按照 CCK8試劑：細胞培養液=1：10，對每個孔加入90-110μL 含CCK8溶液的細胞培養液；
懸浮細胞：直接在原培養液內加入10μL CCK8溶液。
注意：
CCK-8試劑需要避光處理，在加入試劑時需注意對環境進行避光處理，加CCK-8試劑時的速度要快，減少試劑在移液器上的殘留，加入CCK-8試劑后輕輕震蕩96孔板，避免加樣時由于CCK-8 殘留在槍頭或壁上上所帶來的誤差。
加入完畢后細胞繼續放入細胞培養箱內孵育0.5-3h。
孵育完成后，使用酶標儀在450nm 處檢測吸光度。
注意：
建議每半小時測定一次OD值，使其保持在1至2之間后固定顯色時間重復實驗。
用Excel及Graphpad Prism處理并分析結果。
結果示例圖：
No.4
檢測與數據處理
孵育結束后，使用酶標儀在 450nm 波長處測定各孔的吸光度值（OD 值）。記錄數據后，利用 Excel、GraphPad Prism 等軟件進行數據分析，繪制細胞生長曲線、計算細胞增殖抑制率或細胞毒性等指標。
No.5
CCK8常見問題
CCK8法細胞毒活性篩選實驗中會遇到的常見問題
（1）一個孔中應接種多少個細胞？
當使用標準96孔板時，貼壁細胞的最小接種量至少為1,000 個/孔 (100μl 培養基)。檢測白細胞時的靈敏度相對較低，因此推薦接種量不低于2,500 個/孔 (100μl 培養基)。如果要使用24孔板或6孔板實驗，請先計算每孔相應的接種量，并按照每孔培養基總體積的10%加入CCK-8溶液。
（2）哪些物質會影響CCK8的測定？
當有還原性物質存在時會影響CCK-8的測定，例如含有維生素C的Glucose等。在有酚紅存在的情況下，可通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去，不會對檢測造成影響。
（3）能否用384孔板或24孔板進行試驗？
可以。向各孔中加入培養基體積10%的CCK-8溶液，如果加入的CCK-8體積太少，可以先將CCK-8溶液稀釋1倍，然后加入培養基體積20%的量。
（4）CCK-8能否對活細胞進行染色？
不能。因為CCK-8的主要成分是一種水溶性的四唑鹽 (WST-8)，并通過電子載體PMS將活細胞中的電子交換到培養基中的WST8上。由于生成的甲臜也是高度水溶性的，因此CCK-8不能對細胞進行染色。
（5）在實驗中吸光度值太高，如果不能減少細胞數量，如何解決？
可以縮短加入CCK-8后的培養時間。例如: 可以把加入CCK-8試劑后的培養時間由2小時縮短為1小時。
（6）設定參比波長的目的是什么？必須設定嗎？
不一定要設定。CCK-8試劑在參比波長沒有吸光度。設定參比波長的目的是為了取出由于樣品混濁所帶來的吸收。
（7）CCK-8檢測溶液對細胞是否有毒？
加到培養基中的CCK-8是沒有毒性的，因為被稀釋了10倍。因此，長時間的培養，如過夜或者培養數天是可以的。同一個細胞培養液在CCK-8檢測后還可以用于其他細胞增殖檢測，如結晶紫檢測，中性紅檢測或者DNA熒光檢測等。由于每種細胞對于CCK-8的耐受力都不同，因此在需要進行長時間培養時，先檢測一下細胞在加入CCK-8培養后的活力。
（8）CCK-8能否檢測細菌細胞？
可以檢測E.coli，但不能檢測酵母細胞。向100μl E.coli培養液中加入10μl CCK-8溶液，并培養1-4個小時或過夜。
（9）CCK-8穩定嗎？
CCK-8在0-5℃下能夠保存至少6個月，在-20℃下避光可以保存1年。如果需要長期保存，我們推薦-20℃的儲藏條件。CCK-8若反復解凍和冰凍將會增加空白吸收，從而影響檢測結果，若經常使用可將試劑存放在4℃冰箱內保存。
（10）每次測定的數值不一樣，是什么原因？如何解決？
可能會有以下幾個原因：1. 當在培養箱內培養時，培養板最外一圈的孔最容易干燥揮發，由于體積不準確而增加誤差。一般情況下，最外一圈的孔只加培養基，不作為測定孔用。2. 有可能會因為CCK-8沾在壁上而產生誤差，建議在加入CCK-8后，輕輕敲擊培養板以幫助混勻。3. 每孔的細胞數量過多或過少。請預先在1,000-100,000個/孔范圍內摸索條件。
（11）如何設定空白對照？
在不含細胞的培養基中加入CCK-8，培養一定的時間，測定450nm的吸光度即為空白對照。在做加藥實驗(細胞毒性實驗)時，還應考慮藥物的吸收，可在不含細胞，加入藥物的培養基中加入CCK-8，培養一定的時間，測定450 nm的吸光度作為空白對照。
（12）在CCK-8顯色過程中，如何終止反應？
有以下幾種方法（96孔板）：①在顯色反應后，將培養板放置4℃冰箱內。②每孔加10μl 0.1 MHCL溶液。③每孔加10μl的 1%（w/v）的SDS（十二烷基硫酸鈉）溶液。注意：反應停止后，應在24小時之內測定。
（13）必須預培養細胞嗎？
不一定。如果要向保持細胞的最好狀態，建議預培養細胞。如果不做細胞預培養 ，細胞內的脫氫酶可能會不穩定。也有人不做細胞預培養，但在做標準曲線和檢測時需要統一檢測條件。
（14）CCK-8對于不同的細胞，靈敏度是否一樣？
不一樣，懸浮細胞與貼壁細胞相比較難染色。對于貼壁細胞，一般加入CCK-8培養1-4小時吸光度已經很高，但對于懸浮細胞則可能吸光度較低，可以通過延長CCK-8的加入時間或增加細胞數量來解決。
（15）懸浮細胞和貼壁細胞在數量上有何區別？
懸浮細胞由于染色比較困那，一般需要增加細胞數量和延長培養時間。貼壁細胞染色比較容易，若細胞數量過大，有時吸光度會超過酶標儀的讀數。
（16）應該每次做標準曲線嗎？
建議每次做。雖然細胞是一樣的，但是細胞的狀態不一定一樣，對于狀態不一樣的細胞，建議每次做標準曲線。如果試劑的批號不一樣，靈敏度可能會有輕微的差異，對于不同的批號建議分別做標準曲線。
（17）有時在藥物作用情況下，細胞已經死亡，但是脫氫酶的活性還在，是否能計算細胞數量？
不能。由于CCK-8是通過和細胞內的脫氫酶進行反應間接反映活細胞數量，如果細胞已經死亡，但脫氫酶的活性還在，則試劑測定的細胞數量將會比真實值高，不能真實反映活細胞數量，建議采用別的方法測定。
（18）實驗前發現細胞不生長或生長緩慢是什么原因？
a. 細胞狀態不好：可能是因為傳代次數過多或者細胞本身存在異常，導致細胞增殖能力下降。此時，可以嘗試更換細胞株或優化細胞培養條件。
b. 培養條件不合適：如培養基不合適、血清濃度不合適、溫度和濕度不適合等。此時，可以嘗試調整培養條件，選擇更適合的培養基和血清。
c. 污染：細胞可能會被細菌、支原體等微生物感染，導致細胞生長停滯。此時，需要進行消毒和更換新鮮的培養基。
d. 細胞老化：細胞生長到一定階段后，會逐漸進入老化狀態，導致增殖能力下降。此時，可以嘗試進行細胞換株或者優化培養條件。
（19）實驗前發現細胞死亡是什么原因？
a. 血清濃度不合適：血清濃度過高或過低都會導致細胞死亡。此時，可以嘗試調整血清濃度。
b. 溫度和濕度不適合：如果溫度過高或濕度過低，會導致細胞死亡。此時，可以嘗試調整溫度和濕度。
c. 細胞狀態異常：如果細胞狀態異常，如出現染色體異常、基因突變等情況，會導致細胞死亡。此時，需要進行細胞遺傳學檢測和表型分析等實驗來確認細胞的性質。
（20）文獻報道IC50值和實際測定值不一致是什么原因？
a.文獻IC50測定方法和實際測定所用方法存在差異；
b.不同實驗室細胞株來源、代次、培養方法存在差異，可能會影響細胞株對受試藥物的敏感性；
c.實驗操作過程中存在的誤差；
d.受試藥物的純度、配制方法等可能存在差異。
故文獻報道IC50值和實際測定值不一致的情況下需要客觀分析。
主營項目
1. 動物實驗
動物飼養、疾病造模、行為學檢測、心功能、無創血壓、血常規、全自動生化檢測等
2. 細胞實驗
CCK8/MTT、原代細胞分離、流式細胞實驗、細胞劃痕、侵襲、遷移、EDU染色、轉染、穩定株
3. 分子生物學
PCR檢測、熒光定量PCR、絕對定量PCR、端粒酶長度、pull down、雙熒光素酶、SSR、SNP檢測等
4. 蛋白實驗
WB、Co-IP、酵母雙雜
5. 病理實驗
HE染色、免疫組學、電鏡
6. 生理生化實驗
肝腎功能、抗氧化、免疫反應等生理免疫指標;動植物營養指標、微量元素、重金屬、酶活等。
7. 多組學實驗
基因組、轉錄調控、蛋白組、代謝組、微生物多樣性、宏基因組、生信分析
8. 整體課題實驗
方案設計、整體實驗交付、標書寫作、論文潤色、協助投稿
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康旭禾生物提供包括動物實驗、細胞實驗、分子實驗、病理實驗、流式檢測實驗及論文翻譯、潤色、投稿輔助等相關的各項服務。
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