Western Blot—實驗步驟及結果分析
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發表時間：2025-08-07
原理
蛋白質印跡法 (WB) 是一種廣泛使用的基于抗體的技術，借助抗體與目的蛋白（抗原）的特異性結合，檢測細胞或組織提取物中的蛋白質表達水平。
實驗流程圖
小編將詳細介紹蛋白免疫印跡實驗的步驟，并提供結果分析的指導，助大家更好的完成實驗。
實驗步驟
01
樣品制備
蛋白免疫印跡實驗的第一步是樣品制備。通常，您可以從細胞培養物、動物組織或微生物培養物等樣品中收集蛋白質。在此過程中，您需要避免蛋白質的降解和失活。
以下是一般的樣品制備步驟：
a. 收集細胞或組織：使用適當的緩沖液洗滌細胞或組織，以去除雜質和外部污染物。
b. 細胞破碎：加入蛋白提取緩沖液（含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），破壞細胞膜和核膜，釋放蛋白質。
c. 離心：將細胞裂解液或組織裂解液進行離心，去除細胞碎片和核酸等雜質。
d. 收集上清液：將上清液轉移到新的離心管中，以去除未溶解的固體。
02
蛋白質濃度測定
在進行免疫印跡實驗前，您需要確定蛋白質的濃度，以便加載相同的蛋白質量進行電泳分離。有幾種方法可用于測定蛋白質濃度，如BCA法或Bradford法。
a. BCA法（雙硫鍵還原法）：首先，準備一系列蛋白質標準溶液，使用BCA試劑與蛋白質反應，生成可測定光密度的復合物。
b. Bradford法：該方法使用考馬斯亮藍G-250試劑，該試劑與蛋白質結合形成深藍色物質，測量其吸光度。
03
SDS-PAGE電泳
SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝膠電泳）是一種將蛋白質按照分子量大小進行分離的常見方法。以下是簡要的步驟：
a. 準備凝膠：根據實驗需要選擇合適的聚丙烯酰胺凝膠濃度和孔隙度。通常使用10%至15%的凝膠。
b. 配制電泳緩沖液：根據實驗室的標準操作程序制備Tris-緩沖溶液，加入適量的SDS和硫酸銨，調整pH值。將電泳緩沖液加入電泳槽中。
c. 加載樣品：將樣品蛋白質與加載緩沖液混合，加熱至95°C，使之變性。然后，將樣品加載到凝膠孔中。
d. 電泳：將凝膠浸入電泳槽中，將電泳槽兩端連接到電源，施加適當的電壓使蛋白質沿凝膠電泳。
e. 停止電泳：當蛋白質移動到合適位置或接近凝膠底部時，停止電泳。
f. 凝膠染色：使用染色劑（如Coomassie藍染液）對凝膠進行染色，以顯示蛋白質帶狀。
g. 存儲凝膠：將凝膠轉移到顯影儀或圖像記錄系統中，記錄凝膠圖像以備后續分析使用。
04
轉膜
轉膜是將凝膠上的蛋白質遷移到膜上的一個步驟，以便進行抗體的探針檢測。常用的膜材料有聚偏氟乙烯（PVDF）和硝酸纖維素（NC）。以下是轉膜步驟：
a. 準備膜：切割適當大小的膜，并將其在轉膜緩沖液中濕潤。
b. 電泳后處理：取出凝膠，將其在轉膜緩沖液中浸泡一段時間
c. 轉膜裝置組裝：將濕潤的膜放在轉膜裝置上，層疊在凝膠上。確保膜與凝膠之間沒有氣泡。
d. 轉膜操作：將轉膜裝置組裝到轉膜槽中，添加足夠的轉膜緩沖液，使其覆蓋整個膜和凝膠。連接上正負電極，施加適當的電壓，進行轉膜操作。
e. 轉膜結束：當蛋白質完全轉移到膜上后，停止轉膜操作。取出膜并進行后續的處理。
05
封閉
在進行抗體結合之前，需要對膜進行封閉，以避免非特異性結合和減少背景信號。一般會使用牛血清白蛋白（BSA）或脫脂奶粉作為封閉劑。以下是阻斷步驟：
a. 準備封閉緩沖液：在TBST緩沖液中加入適量的封閉劑（通常為5%脫脂奶粉或1% BSA）。
b. 封閉操作：將膜放入封閉緩沖液中，輕輕搖晃，使其完全接觸。
c. 封閉時間：通常封閉操作需要1-2小時，室溫進行。
06
抗體孵育
抗體孵育是關鍵步驟之一，用于特異性結合目標蛋白。以下是抗體孵育步驟：
a. 準備一抗：選擇與目標蛋白特異性結合的一抗。
b. 稀釋抗體：根據供應商提供的建議或先前的優化實驗，將抗體稀釋到適當濃度的封閉緩沖液中。
c. 抗體孵育：將膜放入含有稀釋抗體的封閉緩沖液中，使其與目標蛋白進行特異性結合。孵育溫度和時間根據抗體的要求進行設定。
d. 洗滌：在抗體孵育后，將膜放入封閉緩沖液中進行洗滌，去除非特異性結合的抗體。
07
二抗結合及探針檢測
在經過一抗結合后，通常需要使用與一抗相對應的二抗進行結合，該二抗與一個酶、熒光染料或放射性標記結合，以提供可檢測的信號。
a. 選擇二抗：根據一抗的物種來源，選擇相應的二抗。
b. 稀釋二抗：根據供應商提供的建議或先前的優化實驗，將二抗稀釋到適當濃度的TBST緩沖液中。
c. 二抗結合：將膜放入含有稀釋二抗的TBST緩沖液中，使其與一抗進行結合。
d. 探針檢測：根據二抗的標記物，選擇合適的方法進行探針檢測。例如，可以使用酶底物進行著色、熒光探針進行熒光檢測，或者用放射性探針進行放射性測量。
08
圖像獲取及分析
使用分析系統（如顯影儀、熒光成像儀或放射性顯像系）獲取膜上的圖像，并進行后續的分析。以下是常見的圖像分析步驟：
a. 圖像獲取：將膜放入相應的圖像獲取系統中，進行圖像記錄。
b. 圖像分析：使用圖像處理軟件對圖像進行分析，測量蛋白質帶的密度和大小。
c. 定量分析：通過與適當的內部參考蛋白或總蛋白的相對定量比較，確定目標蛋白的相對表達水平。
結果分析
1.信號強度：根據圖像分析的結果，觀察目標蛋白帶在膜上的信號強度。較強的信號表示高蛋白質表達，較弱的信號可能表示低蛋白質表達。
2.分子量大小：通過與分子量標記品對比，在凝膠上的目標蛋白帶遷移位置來估計其分子量大小。
3.特異性：確保只有目標蛋白帶出現信號，而其他非特異性結合的蛋白不產生信號。檢查其他帶狀信號是否與預期的目標蛋白大小和形態相符。
4.負對照和陽性對照：分析實驗中的負對照和陽性對照結果，以驗證實驗方法的有效性和可靠性。
5.統計學分析：使用適當的統計學方法（如t檢驗或方差分析）對結果進行統計學分析，確定差異的顯著性。
需要注意的是，蛋白免疫印跡實驗是一種復雜的技術，結果分析需要綜合考慮實驗中的多個因素，并結合之前的研究背景和目的進行解讀，對于結果的進一步分析和解釋，可能需要借助其他實驗或技術的支持。
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