qPCR | 熒光定量PCR的曲線，你了解多少？
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發(fā)表時(shí)間：2025-08-12
熒光定量PCR（qPCR）是一種在標(biāo)準(zhǔn)PCR技術(shù)基礎(chǔ)上演變而成的技術(shù)，主要用于定量樣本中的DNA或RNA。它通過監(jiān)測每個(gè)PCR循環(huán)中擴(kuò)增產(chǎn)物的量，實(shí)現(xiàn)對(duì)靶點(diǎn)起始量的精確測定。本文將深入探討熒光定量PCR中的關(guān)鍵曲線，包括擴(kuò)增曲線、熔解曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線。
qPCR擴(kuò)增程序
熒光定量PCR的擴(kuò)增程序分為擴(kuò)增反應(yīng)階段和熔解反應(yīng)階段。
1.擴(kuò)增反應(yīng)階段
擴(kuò)增反應(yīng)階段采用兩步法，即每個(gè)循環(huán)結(jié)束后，即刻檢測熒光信號(hào)。這種實(shí)時(shí)監(jiān)測方式使得qPCR能夠動(dòng)態(tài)地捕捉擴(kuò)增過程中的熒光信號(hào)變化，進(jìn)而生成擴(kuò)增曲線。擴(kuò)增曲線反映了靶標(biāo)DNA片段的指數(shù)擴(kuò)增階段，曲線上的熒光強(qiáng)度隨PCR循環(huán)數(shù)的增加而呈指數(shù)增長。該曲線的斜率（或Ct值）與起始模板的量呈負(fù)相關(guān)，可以準(zhǔn)確地定量目標(biāo)基因的表達(dá)水平。
2.熔解反應(yīng)階段
在擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，設(shè)置熔解反應(yīng)程序，使雙鏈DNA產(chǎn)物逐步解鏈，并檢測熒光信號(hào)的變化。不同序列的DNA片段在不同的溫度下解鏈，熔解曲線呈現(xiàn)出峰值，峰值溫度可以用于判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。如果存在非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，熔解曲線會(huì)表現(xiàn)出多峰現(xiàn)象，從而提示可能存在雜交帶或其他非目標(biāo)序列的擴(kuò)增。
擴(kuò)增曲線
在PCR反應(yīng)過程中，熒光信號(hào)的強(qiáng)度隨著循環(huán)次數(shù)的增加而增加。擴(kuò)增曲線顯示了熒光信號(hào)隨時(shí)間的變化，通常在Ct值（閾值循環(huán)數(shù)）處會(huì)有明顯的信號(hào)上升，表示目標(biāo)DNA的擴(kuò)增開始。理想情況下，PCR產(chǎn)物呈指數(shù)增長，導(dǎo)致曲線呈典型的“S”形。然而，實(shí)際反應(yīng)過程中，多種因素會(huì)影響擴(kuò)增效率，例如酶活性降低、底物耗盡以及產(chǎn)物抑制等，最終導(dǎo)致曲線從指數(shù)期過渡到平臺(tái)期。
擴(kuò)增曲線的三個(gè)階段
1.熒光背景信號(hào)階段（基線期）：
在這個(gè)階段，熒光信號(hào)的強(qiáng)度非常低，幾乎沒有顯著變化。此時(shí)，PCR反應(yīng)中的熒光信號(hào)主要來自于背景噪聲。
熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段（對(duì)數(shù)期）：
隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，目標(biāo)DNA的數(shù)量開始迅速增加，熒光信號(hào)也隨之上升。此階段的熒光信號(hào)呈指數(shù)級(jí)增長，通常是數(shù)據(jù)分析的關(guān)鍵部分，因?yàn)樵诖穗A段可以準(zhǔn)確測定Ct值（閾值循環(huán)數(shù)）。
平臺(tái)期（擴(kuò)增產(chǎn)物不再呈指數(shù)級(jí)增加）：
當(dāng)PCR反應(yīng)接近完成時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量達(dá)到飽和，熒光信號(hào)的增加速度減緩，最終趨于平穩(wěn)。這一階段的信號(hào)變化較小，通常不用于定量分析。
通過分析擴(kuò)增曲線，可以評(píng)估PCR反應(yīng)的效率和特異性，并推斷樣本中目標(biāo)DNA的初始量，為后續(xù)的定量分析提供依據(jù)。
擴(kuò)增曲線示意圖
在擴(kuò)增曲線中這幾個(gè)專業(yè)術(shù)語了解一下：
基線：是指在PCR擴(kuò)增初期，熒光信號(hào)未顯著增加的階段，通常用于確定Ct值的起始點(diǎn)。基線設(shè)置在擴(kuò)增曲線的平緩部分，通常為PCR的最初3至15個(gè)循環(huán)；可自動(dòng)生成或手動(dòng)設(shè)置，設(shè)置時(shí)需確保消除熒光背景的同時(shí)，不覆蓋非熒光背景的擴(kuò)增信號(hào)。
閾值：是在擴(kuò)增曲線的指數(shù)增長區(qū)域內(nèi)，選擇的熒光檢出界限。閾值應(yīng)位于曲線的指數(shù)期中間，通常設(shè)置為基線熒光值標(biāo)準(zhǔn)差的10倍。對(duì)于不同基因的擴(kuò)增，可以單獨(dú)設(shè)置閾值，但同一個(gè)基因的擴(kuò)增必須保持相同的閾值。
Ct值（Cycle threshold）：是指在熒光PCR擴(kuò)增過程中，當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)。Ct值與模板的拷貝數(shù)存在著線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。Ct值通常取15至35之間的值，過大或過小都會(huì)影響定量分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。
2.優(yōu)良的擴(kuò)增曲線的特點(diǎn)
清晰的基線期：在熒光背景信號(hào)階段，曲線保持平穩(wěn)，未出現(xiàn)明顯的熒光信號(hào)升高。指數(shù)擴(kuò)增階段：在對(duì)數(shù)期，曲線呈現(xiàn)出陡峭的上升趨勢，顯示出熒光信號(hào)的快速增加，表明PCR產(chǎn)物在有效擴(kuò)增。平臺(tái)期：在擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到飽和后，曲線應(yīng)趨于平穩(wěn)，表示擴(kuò)增不再呈指數(shù)級(jí)增加。
擴(kuò)增效率：理想的擴(kuò)增效率應(yīng)在90%-110%之間，確保每個(gè)循環(huán)中DNA的有效倍增。
無非特異性擴(kuò)增：擴(kuò)增曲線應(yīng)無多余的條帶或信號(hào)，確保特異性擴(kuò)增目標(biāo)序列。
一致的重復(fù)性：在重復(fù)實(shí)驗(yàn)中，擴(kuò)增曲線應(yīng)表現(xiàn)出一致性，確保結(jié)果的可靠性。
熔解曲線
熔解曲線分析是在PCR擴(kuò)增結(jié)束后進(jìn)行的，通過逐漸升高溫度來分析PCR產(chǎn)物的特性。熔解曲線顯示了DNA雙鏈在特定溫度下解鏈的過程，能夠幫助確認(rèn)擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性和純度。
1.原始圖譜與導(dǎo)數(shù)圖譜
熔解曲線原始圖譜通常展示了PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在不同溫度下的熒光強(qiáng)度變化。
原始圖譜示意圖
熔解曲線導(dǎo)數(shù)圖譜主要用于更清晰地展示PCR產(chǎn)物在不同溫度下的解離特性。
導(dǎo)數(shù)圖譜示意圖
2.熔解曲線解析
通常情況下，熒光定量PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物長度在80到200個(gè)堿基對(duì)之間，對(duì)應(yīng)的熔解溫度大約在80到90℃。如果陰性對(duì)照沒有擴(kuò)增，可以通過熔解曲線來驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性：
單峰：如果在80到90℃之間出現(xiàn)一個(gè)清晰的單峰，說明PCR產(chǎn)物特異性很好，擴(kuò)增成功。
雙峰：如果出現(xiàn)兩個(gè)峰，主峰在80到90℃之間，雜峰在80℃以下（通常60到75℃），可能是存在引物二聚體。可以嘗試提高退火溫度、降低引物濃度或重新設(shè)計(jì)引物來改善。
非特異性擴(kuò)增：如果主峰在80到90℃，而在90℃以上又有雜峰，通常表示非特異性擴(kuò)增。若是基因組DNA污染導(dǎo)致的，可以通過設(shè)計(jì)跨內(nèi)含子的引物或去除基因組DNA來解決。
標(biāo)準(zhǔn)曲線
構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成至少5個(gè)不同濃度。橫軸代表起始拷貝數(shù)，縱軸為Ct值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以建立Ct值與拷貝數(shù)之間的定量關(guān)系。
標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖
標(biāo)準(zhǔn)曲線的一些參數(shù)能夠反映熒光定量PCR體系的性能，其中斜率反映了PCR的擴(kuò)增效率。理論上斜率為-3.32，表示100%的擴(kuò)增效率，這意味著每個(gè)循環(huán)PCR產(chǎn)物量理論上翻倍。
實(shí)際實(shí)驗(yàn)中，PCR反應(yīng)并非每個(gè)循環(huán)都實(shí)現(xiàn)完美倍增，通常有以下兩種情況：
1. 若擴(kuò)增效率低于100%，可能是由于引物、試劑或反應(yīng)條件不合適，或標(biāo)準(zhǔn)品稀釋不準(zhǔn)確。
2. 若擴(kuò)增效率高于100%，則可能存在抑制因素，如模板質(zhì)量差或濃度過高，非特異性擴(kuò)增也可能導(dǎo)致效率過高，需要通過熔解曲線進(jìn)一步驗(yàn)證。
因此，擴(kuò)增效率在90%至110%的范圍內(nèi)，仍可用于數(shù)據(jù)分析。但效率偏離此范圍，則需謹(jǐn)慎對(duì)待結(jié)果，并追溯潛在因素。
好的，熒光定量的三種曲線講解就到這里了，希望大家有所收獲~點(diǎn)贊關(guān)注康旭禾生物，不定期給大家分享更多實(shí)用的干貨！
主營項(xiàng)目
1. 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
動(dòng)物飼養(yǎng)、疾病造模、行為學(xué)檢測、心功能、無創(chuàng)血壓、血常規(guī)、全自動(dòng)生化檢測等
2. 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)
CCK8/MTT、原代細(xì)胞分離、流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕、侵襲、遷移、EDU染色、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定株
3. 分子生物學(xué)
PCR檢測、熒光定量PCR、絕對(duì)定量PCR、端粒酶長度、pull down、雙熒光素酶、SSR、SNP檢測等
4. 蛋白實(shí)驗(yàn)
WB、Co-IP、酵母雙雜
5. 病理實(shí)驗(yàn)
HE染色、免疫組學(xué)、電鏡
6. 生理生化實(shí)驗(yàn)
肝腎功能、抗氧化、免疫反應(yīng)等生理免疫指標(biāo);動(dòng)植物營養(yǎng)指標(biāo)、微量元素、重金屬、酶活等。
7. 多組學(xué)實(shí)驗(yàn)
基因組、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白組、代謝組、微生物多樣性、宏基因組、生信分析
8. 整體課題實(shí)驗(yàn)
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