干貨分享：常用的蛋白分析技術——WB實驗操作步驟詳解
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發表時間：2025-08-13
WB實驗，是一種常用的蛋白分析技術。實驗中每一步的把握，將會直接影響結果的顯現。本文將給大家展示WB實驗的詳細操作步驟。跟小編一起來看看吧~
蛋白樣品的提取及蛋白含量的檢測
蛋白樣品的好壞，直接決定了能否做出來蛋白條帶，所以蛋白樣品的提取需嚴格按照試劑盒說明書進行。
凝膠配置
凝膠選擇：請根據蛋白分子量的大小，選擇合適濃度的分離膠，可參考凝膠配置試劑盒中的說明書，或者參考文獻。配膠的APS需要在4° 的冰箱中保存。注意，配膠的時候，膠一定一定要混勻。配膠的試劑中，APS與TEMED是促凝劑，所以在加促凝劑之前，需先把其他組分混勻。
操作：將配置好的分離膠沿著玻璃板一側緩慢打入玻璃板中，這個時候不用擔心打入氣泡。灌入合適量的分離膠之后，加入適當劑量的ddWater或者無水乙醇封膠。（加入封膠試劑量沒有規定，蓋住整個分離膠膠面即可）
上樣
Marker孔加入5-10μL，其余蛋白總上樣量30-50μg.
電泳
接上電源后，先用80V恒壓電泳至溴酚藍指示劑到濃縮膠與分離膠交界處，成線狀，改為恒壓120v直至溴酚藍電泳到凝膠底部，此過程約用時1.5h。
小貼士：根據實驗要求可以進行適當調整，蛋白條帶較大時，可延長電泳時間；條帶較小時，參照預染Marker條帶決定電泳時間。電泳開始的時候，開制冰機制冰，為后面的轉膜做準備。
轉膜（濕轉）
操作步驟
1. 取出凝膠，根據Marker切下目的條帶，用蒸餾水沖洗，并裁剪與SDS-PAGE凝膠相同大小的PVDF膜，濾紙應與纖維墊相同大小；
2.PVDF膜用甲醇浸泡1min后，和濾紙一同浸泡于電轉緩沖液中；
3. 按照黑色板-纖維墊-濾紙-凝膠-PVDF膜-濾紙-纖維墊-白色板依次放好，夾緊板后放入濕轉電轉槽內，黑色板的一面對黑色負極；
4.在轉膜槽中加滿電轉液，開始轉膜。（轉膜槽置于水中，并放入冰凍結塊的冰袋，盡量多放幾個冰袋，保證電轉一直處于低溫下進行。若轉膜時間較長，中途溫度升高，可更換冰袋）
小貼士：蛋白大小大于140kD條件下，先在電流200mA情況下轉膜120min，然后將電流提高到250mA，繼續轉膜30min。
封閉和抗體的孵育
漂洗
PVDF膜置于回旋振蕩器上漂洗1min，重復漂洗2-3次。
封閉
用含5% 脫脂奶粉的TBST（封閉液）浸泡PVDF膜，室溫搖床封閉2h。磷酸化蛋白用5%的BSA封閉2h。
一抗孵育
用含5%脫脂奶粉的TBST（檢測磷酸化蛋白用含5% BSA的TBST）稀釋相應的一抗，使PVDF膜浸泡于一抗孵育液中，4℃孵育過夜。
洗滌
TBST充分洗滌PVDF膜3次，15min/次。
二抗孵育
用稀釋一抗體系相同的稀釋液稀釋HRP標記二抗，使PVDF膜浸泡于二抗孵育液中，室溫孵育1h。
洗滌
TBST充分洗滌PVDF膜4次，15min/次。
顯色曝光
ECL發光液A液與B液1：1混合（現配現用）；
PVDF膜從TBST洗液中取出后，用濾紙吸干水分（一般用干凈鑷子夾住PVDF膜，讓膜的一角接觸濾紙）；
將PVDF放置于成像儀上，均勻滴加ECL工作液，排出氣泡，開始曝光。
小貼士：先選擇自動曝光進行曝光。同一張膜上未曝光出條帶的，可選擇手動曝光，加長時間再次曝光。
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