【科研必備】秒懂文獻蛋白互作圖：從 STRING 網(wǎng)絡(luò)到 Co-IP 結(jié)果的全類型解析！
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發(fā)表時間：2025-08-26
一、酵母雙雜交
酵母雙雜交實驗是一種經(jīng)典的分子生物學技術(shù)，廣泛用于研究蛋白質(zhì)之間的相互作用。本實驗旨在通過酵母雙雜交系統(tǒng)驗證NF-YC9蛋白與BIN2蛋白之間是否存在相互作用。實驗設(shè)計包括以下幾部分：
1. 實驗材料與培養(yǎng)基
培養(yǎng)基：
二缺板（SD/-Trp/-Leu）：用于初步篩選融合蛋白的表達情況，同時排除單個融合蛋白的自激活現(xiàn)象。
四缺板（SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade）：用于進一步驗證蛋白質(zhì)之間的相互作用，通過檢測報告基因（如HIS3和ADE2）的表達來判斷互作的強度和可靠性。
2. 實驗分組
①實驗組：本實驗的核心目標是驗證NF-YC9與BIN2蛋白之間是否存在相互作用。通過將NF-YC9和BIN2分別構(gòu)建到酵母雙雜交系統(tǒng)的兩個融合蛋白載體中，觀察其在酵母細胞中的互作情況。
②陰性對照：設(shè)置陰性對照組，以確保實驗結(jié)果的可靠性。陰性對照組中，兩個融合蛋白之間不存在已知的相互作用，用于排除背景信號和非特異性結(jié)合的可能性。
陽性對照：選用已知存在相互作用的蛋白對（如BZR1與BIN2）作為陽性對照，以驗證實驗系統(tǒng)的有效性和可靠性。陽性對照組的預期結(jié)果為在四缺板上能夠正常生長，且生長情況良好。
3. 實驗結(jié)果分析
在實驗過程中，我們分別將實驗組、陰性對照組和陽性對照組的酵母菌株接種到二缺板（SD/-Trp/-Leu）和四缺板（SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade）上進行培養(yǎng)。經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)后，觀察菌落的生長情況。
①二缺板（SD/-Trp/-Leu）：在二缺板上，實驗組、陰性對照組和陽性對照組均能夠正常生長，說明構(gòu)建的融合蛋白載體在酵母細胞中成功表達，且酵母細胞能夠正常生長和代謝。
②四缺板（SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade）：在四缺板上，陽性對照組的酵母菌落生長良好，說明已知的蛋白對（BZR1與BIN2）之間存在明確的相互作用，且實驗系統(tǒng)運行正常。陰性對照組的酵母菌落未能生長，表明實驗系統(tǒng)能夠有效區(qū)分非特異性結(jié)合和背景信號。而實驗組的酵母菌落也在四缺板上生長，且生長情況與陽性對照組相似。
二、pull-down
Western Blot 檢測
以 GST-BIN2 作為誘餌時：在 Western Blot 檢測中，可以清晰地檢測到 His-NF-YC9 蛋白的特異性條帶。這表明 GST-BIN2 誘餌蛋白能夠成功捕獲 His-NF-YC9 獵物蛋白，說明兩者之間存在相互作用。
以 GST 作為誘餌時：在 Western Blot 檢測中，未檢測到 His-NF-YC9 蛋白的特異性條帶。這表明 GST 誘餌蛋白無法捕獲 His-NF-YC9 獵物蛋白，說明 GST-BIN2 與 His-NF-YC9 的相互作用具有特異性，而非由于非特異性結(jié)合導致。
三、BiFC
1、實驗組：在實驗組中，觀察到明顯的 YFP 熒光信號，表明 GST-BIN2-N-YFP 和 His-NF-YC9-C-YFP 融合蛋白之間發(fā)生了相互作用，導致 YFP 的兩個片段重新組裝并恢復熒光。
2、陰性對照組：在陰性對照組中，未觀察到 YFP 熒光信號，說明 GST 蛋白與 His-NF-YC9 蛋白之間不存在相互作用，驗證了實驗系統(tǒng)的特異性。
3、共定位分析：在圖像疊加（Merge）分析中，YFP 熒光信號與核定位標記蛋白 VirD2NLS-mCherry 的紅色熒光信號有明顯的共定位現(xiàn)象。這表明 GST-BIN2 與 His-NF-YC9 的相互作用發(fā)生在細胞核內(nèi)。
四、CO-IP
1、實驗組：在 Western Blotting 圖像中，清晰地檢測到 BIN2-MYC 和 NF-YC9-FLAG 的特異性條帶。這表明在細胞環(huán)境中，BIN2-MYC 與 NF-YC9-FLAG 蛋白能夠形成穩(wěn)定的復合物，且兩者之間存在體內(nèi)相互作用。
2、陰性對照組：在陰性對照組中，未檢測到 NF-YC9-FLAG 的特異性條帶，僅檢測到少量的非特異性背景信號。這表明實驗組中 NF-YC9-FLAG 的捕獲是特異性的，排除了抗體的非特異性結(jié)
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