-
- 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)平臺(tái)
- 動(dòng)物飼養(yǎng) 疾病造模 行為學(xué)檢測(cè) 心功能 無(wú)創(chuàng)血壓 血常規(guī) 全自動(dòng)生化檢測(cè)等
- 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)平臺(tái)
- CCK8/MTT 原代細(xì)胞分離 流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞劃痕 侵襲 遷移 EDU染色 轉(zhuǎn)染 穩(wěn)定株篩選
動(dòng)物模型構(gòu)建：頂刊23分文章帶你弄懂胰腺炎
瀏覽：36
發(fā)表時(shí)間：2025-08-26
大小鼠胰腺炎模型
小伙伴們，大家好，今天我們將通過(guò)一篇文章來(lái)了解大小鼠的胰腺炎模型，本文發(fā)表在2024年1區(qū)Top醫(yī)學(xué)期刊《Gut》上，影響因子為23。標(biāo)題為“Pancreas-directed AAV8-hSPINK1 gene therapy safely and effectively protects against pancreatitis in mice”。
文章討論是一種基于腺相關(guān)病毒（AAV8）介導(dǎo)的人類SPINK1基因（hSPINK1），在感染小鼠的胰腺轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和安全性，以及三種小鼠模型（雨蛙素誘導(dǎo)、胰管結(jié)扎和Spink1 C .194+2T>C小鼠模型）中預(yù)防和治療胰腺炎的效果。
一、
研究背景
慢性胰腺炎（CP）是一種由遺傳和環(huán)境因素引起的終身進(jìn)行性纖維炎性疾病。其特征是腹痛，急性胰腺炎（AP）反復(fù)發(fā)作，胰腺功能隨時(shí)間推移而惡化，導(dǎo)致患者生活質(zhì)量顯著降低。CP的患病率從每10萬(wàn)人13.5例到52.4例不等，并且在過(guò)去二十年中穩(wěn)步增加，造成了很高的疾病負(fù)擔(dān)。CP也顯著增加胰腺癌的風(fēng)險(xiǎn)。不幸的是，目前還沒(méi)有根治CP的方法，迫切需要有效的治療和疾病預(yù)防策略。
二、
模型構(gòu)建
文獻(xiàn)中使用的造模方法：
1. 雨蛙素誘導(dǎo)
①以每隔1 h腹腔注射7次雨蛙素（100 μ g/kg體重），建立雨蛙素誘導(dǎo)的AP小鼠模型。
②通過(guò)反復(fù)發(fā)作AP，建立雨蛙素誘導(dǎo)的CP模型，小鼠按體重50 μ g/kg/小時(shí)腹腔注射雨蛙素6次。每次注射間隔1小時(shí)，每周3天，共連續(xù)4周。
2. 膽管結(jié)扎
①結(jié)扎誘導(dǎo)AP模型，結(jié)扎連接十二指腸的膽胰總管，結(jié)扎后24小時(shí)取組織標(biāo)本。
②結(jié)扎胃和十二指腸葉交界處胰管誘導(dǎo)CP模型，結(jié)扎28天后處死小鼠。
3. Spink1 C .194+2T>C小鼠模型
利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建Spink1 C .194+2T>C突變小鼠模型。使用引物小鼠Spink1-F 5‘-TACTCAGCTTTTCTGAT TTCAGGGC-3’和小鼠Spink1-R 5‘-GCTAATGAGAGGGTGCATTAGAACA TG-3’對(duì)小鼠基因型進(jìn)行Sanger DNA測(cè)序驗(yàn)證?？紤]到一些雜合子（Spink1+/?）小鼠在14周時(shí)發(fā)生自發(fā)性胰腺損傷，我們用AAV8-hSPINK1載體或無(wú)病毒對(duì)照治療10周齡小鼠。在14周齡時(shí)收獲小鼠，無(wú)論是否誘導(dǎo)AP。
*補(bǔ)充造模方法：
1. L-精氨酸（L-Arginine）腹腔注射法
L-Arg誘導(dǎo)AP動(dòng)物模型，通常劑量為250-500mg/100g。L-Arg的作用呈劑量和時(shí)間依賴性，單次注射L-Arg 500mg/100g，70-80%胰腺腺泡細(xì)胞在3d內(nèi)壞死，3次注射L-Arg 250mg/100g超過(guò)10d，近90%的腺泡被破壞。
造模方法：大鼠：1次腹腔內(nèi)給藥1g/kg；小鼠：腹腔注射8% L -Arg 4 g/kg，連續(xù)2次，間隔1h。
2. 牛磺膽酸鈉（Sodium Taurocholate, NaT）逆行胰膽管注射法?
?操作流程?：麻醉小鼠后開腹，穿刺膽胰管并注射2-3%牛磺膽酸鈉溶液（30-50 μL，10 μL/min），夾閉肝門膽管5分鐘促進(jìn)溶液擴(kuò)散?。
?病理特征：24小時(shí)內(nèi)胰腺出血壞死，伴腹腔皂化斑形成，模擬急性壞死性胰腺炎（ANP）?。
3. 乙硫氨酸缺乏膽堿飼料法
?操作流程?：飼喂含0.5% DL-乙硫氨酸的無(wú)膽堿飼料，連續(xù)6天?。
?病理特征?：胰腺腺泡萎縮，纖維化增生，適用于慢性胰腺炎研究?。
三、
文獻(xiàn)解讀
1. AAV8 -hSPINK1是一種安全的胰腺表達(dá)載體，在正常小鼠中具有高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和強(qiáng)表達(dá)能力
為了分析這種衣殼優(yōu)化的AAV8載體的體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，作者將生理鹽水和四種不同劑量的載體（1×1011至5×1011 vg/只）腹腔注射給8周齡小鼠（每組n=3）。mNeonGreen表達(dá)的熒光顯微鏡顯示，AAV8載體的最佳轉(zhuǎn)導(dǎo)效率為2 ×1011 vg/只（圖1A）。
為研究安全性，作者測(cè)試了這種修飾的載體是否對(duì)胰腺或其他重要器官有任何毒性作用。在理想的載體劑量（2 ×1011 vg/只動(dòng)物）下，衣殼優(yōu)化的AAV8載體特異性靶向胰腺，對(duì)心臟、肺、脾、肝和腎的器官趨向性較低（圖1B）。并進(jìn)一步評(píng)估了給藥不同劑量AAV8載體的小鼠肝腎功能的血清指標(biāo)，結(jié)果顯示肝腎功能指標(biāo)均在正常范圍內(nèi)（圖1C）。
圖一
這些小鼠在治療2周到8周后，胰腺中RNA和蛋白質(zhì)水平上的綠色熒光和hSPINK1表達(dá)都很強(qiáng)勁，在第4周達(dá)到峰值（被認(rèn)為是最佳表達(dá)時(shí)間）（圖2A - c）。這種表達(dá)在12周后仍然可以檢測(cè)到。重要的是，在給藥AAV8-hSPINK1后的8周內(nèi)，對(duì)肝腎功能或胰腺指標(biāo)沒(méi)有顯著影響。
圖二
此外作者用小鼠胰腺裂解物中約50μg的總蛋白進(jìn)行了定量western blotting，并通過(guò)胰蛋白酶對(duì)牛胰蛋白酶的抑制活性測(cè)定，測(cè)量了胰腺勻漿中SPINK1的總活性，還在注射后4周對(duì)生理鹽水處理和AAV8-hSPINK1處理的小鼠進(jìn)行了胰腺RNA- seq分析，總之，這些發(fā)現(xiàn)支持單劑量AAV8- - hSPINK1基因在體內(nèi)的安全性和穩(wěn)健性表達(dá)。
2. AAV8-hSPINK1可減輕雨蛙素誘導(dǎo)的AP發(fā)作和嚴(yán)重程度，加速胰腺恢復(fù)
為了評(píng)估胰腺損傷的程度，通過(guò)末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dutpnick末端標(biāo)記（TUNEL）染色和cleaved caspase-3免疫熒光來(lái)評(píng)估胰腺凋亡。結(jié)果顯示，與雨蛙素刺激對(duì)照組相比，AAV8-hspink1組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量較低（圖3E）。通過(guò)透射電子顯微鏡（TEM）觀察到，在雨蛙素處理的對(duì)照組胰腺腺泡細(xì)胞中，廣泛的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，酶原顆粒和含有細(xì)胞器的自噬液泡增加。
相比之下，在AAV8-hspink1組中很少觀察到這些明顯的病理改變（圖3E）。為了進(jìn)一步評(píng)估自噬水平，作者采用免疫熒光法研究了自噬的標(biāo)志——微管相關(guān)蛋白1輕鏈3 β (LC3B)的表達(dá)。34結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，AAV8-hspink1組LC3B水平明顯降低（圖3F）。
圖三
與無(wú)病毒對(duì)照組相比，包括胰腺/體重、胰腺組織學(xué)變化和血清淀粉酶水平在內(nèi)的多項(xiàng)參數(shù)一致表明，注射后2周至8周，AAV8-hspink1治療持續(xù)減輕雨蛙素誘導(dǎo)的胰腺炎（在線補(bǔ)充圖6）。且AAV8-hspink1組即使在高劑量下也能顯著緩解雨蛙素刺激的胰腺炎。
3. AAV8 -hSPINK1可改善雨蛙素誘導(dǎo)的CP
在無(wú)病毒對(duì)照組和AAV8對(duì)照組中，胰腺-體重比均顯著下降，胰腺切片顯示結(jié)構(gòu)異常，腺體廣泛萎縮和炎癥浸潤(rùn)（圖4B）。天狼星紅染色顯示間質(zhì)彌漫性纖維化，α-平滑肌肌動(dòng)蛋白表達(dá)增加；細(xì)胞角蛋白19 （CK-19）水平升高（圖4C，D，在線補(bǔ)充圖6A）表明，腺泡-到-導(dǎo)管化生（ADM）很明顯。然而，AAV8-hspink1處理組胰腺表現(xiàn)出較不明顯的形態(tài)學(xué)異常（圖4B-D）， CD45-陽(yáng)性和F4/80-陽(yáng)性細(xì)胞的胰腺浸潤(rùn)較少，血清炎癥因子水平較低（在線補(bǔ)充圖5C，D）。且在AAV8-hSPINK1組中，胰腺明顯快速恢復(fù)，胰腺/體重、組織學(xué)變化和血清淀粉酶水平分別在24、48和12小時(shí)內(nèi)恢復(fù)正常（在線補(bǔ)充圖8）?？傊@些研究結(jié)果表明，AAV8介導(dǎo)的hSPINK1在胰腺中的表達(dá)可以顯著改善細(xì)小蛋白誘導(dǎo)的AP至少8周，預(yù)防嚴(yán)重AP并促進(jìn)胰腺快速恢復(fù)。
圖四
4. AAV8-hSPINK1可減輕胰管結(jié)扎模型的炎癥和纖維化
與AAV8-hSPINK1-處理小鼠相比，無(wú)病毒對(duì)照組的胰腺顯示出嚴(yán)重的宏觀水腫和出血（圖5B，在線補(bǔ)充圖10）。無(wú)病毒對(duì)照組胰腺間質(zhì)和腺泡間水腫廣泛，腺泡細(xì)胞大量壞死，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯；相比之下，AAV8-hSPINK1治療顯著降低了胰腺組織組織學(xué)評(píng)分和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（圖5C，在線補(bǔ)充圖11A）。與無(wú)病毒對(duì)照小鼠相比，AAV8-hSPINK1處理小鼠的組織學(xué)評(píng)分較低，與血清炎癥因子和淀粉酶水平改善以及細(xì)胞凋亡和自噬標(biāo)志物表達(dá)水平降低相關(guān)（圖5D，E，在線補(bǔ)充圖11B）。
圖五
作者進(jìn)一步通過(guò)部分結(jié)扎胰管28構(gòu)建CP模型，以模擬臨床所見的胰總管結(jié)石梗阻。所有動(dòng)物都能耐受手術(shù)并恢復(fù)良好。假手術(shù)或結(jié)扎術(shù)后4周摘取胰腺（每組n=4）（圖6A）。無(wú)病毒對(duì)照組胰腺明顯萎縮：H&E染色顯示胰腺腺泡細(xì)胞大量丟失，脂肪沉積（圖6B）；Sirius Red染色及免疫組化分析顯示，部分胰管結(jié)扎導(dǎo)致胰腺纖維化和壞死增加，與細(xì)胞凋亡和自噬水平升高相關(guān)（圖6C、D，在線補(bǔ)充圖11C）。
然而，與無(wú)病毒對(duì)照組相比，AAV8-hSPINK1治療顯著降低了所有纖維化和炎癥標(biāo)志物，以及細(xì)胞凋亡和自噬水平。這些結(jié)果表明，在遺傳水平上過(guò)表達(dá)hSPINK1可以阻止導(dǎo)管阻塞誘導(dǎo)的AP和CP的進(jìn)展。
圖六
5.AAV8-hSPINK1載體可改善spink1 c .194+2T>C突變小鼠胰腺病理改變，降低胰腺炎易感性
H&E和Sirius Red染色均顯示治療小鼠無(wú)自發(fā)性胰腺損傷表型（0.0%,0/12）（圖7A，B，在線補(bǔ)充圖12A）。此外，透射電鏡顯示，未處理的Spink1+/?小鼠在出生后14周的胰腺腺泡細(xì)胞發(fā)生了明顯的超微結(jié)構(gòu)改變，包括“輪狀體”形成的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和頻繁的酶原顆粒；而用aav8 - hspink1載體處理的Spink1+/ -小鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)略微擴(kuò)張，酶原顆粒較少（在線補(bǔ)充圖12B）。
因此=AAV8-hSPINK1可減輕Spink1+/?小鼠的自發(fā)性胰腺損傷。此外，作者給Spink1+/?小鼠注射濃度為100和50 μg/kg的雨蛙素（每組n=3）。AAV8-hSPINK1處理的spink1 +/?小鼠在注射后4周表現(xiàn)出相對(duì)正常的胰腺表型，而未處理的Spink1+/?小鼠對(duì)100和50 μg/kg的雨蛙素刺激都很敏感，導(dǎo)致顯著的胰腺水腫和腺泡細(xì)胞死亡（圖7C，D）。
圖七
四、
結(jié)論
綜上所述，本工作首次證明了AAV8-hSPINK1介導(dǎo)的基因治療胰腺炎具有較高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和安全性。該療法的有效性已在多種胰腺炎小鼠模型中得到證實(shí)，為基因治療策略成功治療臨床胰腺炎提供了臨床前實(shí)驗(yàn)證據(jù)。進(jìn)一步探索AAV8-hSPINK1在大型動(dòng)物和非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型中的可行性和有效性是必要的。
主營(yíng)項(xiàng)目
1. 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
動(dòng)物飼養(yǎng)、疾病造模、行為學(xué)檢測(cè)、心功能、無(wú)創(chuàng)血壓、血常規(guī)、全自動(dòng)生化檢測(cè)等
2. 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)
CCK8/MTT、原代細(xì)胞分離、流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕、侵襲、遷移、EDU染色、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定株
3. 分子生物學(xué)
PCR檢測(cè)、熒光定量PCR、絕對(duì)定量PCR、端粒酶長(zhǎng)度、pull down、雙熒光素酶、SSR、SNP檢測(cè)等
4. 蛋白實(shí)驗(yàn)
WB、Co-IP、酵母雙雜
5. 病理實(shí)驗(yàn)
HE染色、免疫組學(xué)、電鏡
6. 生理生化實(shí)驗(yàn)
肝腎功能、抗氧化、免疫反應(yīng)等生理免疫指標(biāo);動(dòng)植物營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)、微量元素、重金屬、酶活等。
7. 多組學(xué)實(shí)驗(yàn)
基因組、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白組、代謝組、微生物多樣性、宏基因組、生信分析
8. 整體課題實(shí)驗(yàn)
方案設(shè)計(jì)、整體實(shí)驗(yàn)交付、標(biāo)書寫作、論文潤(rùn)色、協(xié)助投稿
聯(lián)系我們
康旭禾生物提供包括動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、分子實(shí)驗(yàn)、病理實(shí)驗(yàn)、流式檢測(cè)實(shí)驗(yàn)及論文翻譯、潤(rùn)色、投稿輔助等相關(guān)的各項(xiàng)服務(wù)。
聯(lián)系方式：15579126092
公司官網(wǎng)：http://consurebio.com/
公司地址：江西省南昌市南昌縣小藍(lán)VR產(chǎn)業(yè)基地D座2樓
點(diǎn)擊右上角
分享給朋友吧
長(zhǎng)按圖片保存/分享
36
電話：19379182007
郵箱：sale@consurebio.com
QQ：3954404680
地址：南京市鼓樓區(qū)新河一村11號(hào)4幢1486室
實(shí)驗(yàn)室地址：江西省南昌市南昌縣小藍(lán)VR產(chǎn)業(yè)基地D座2樓
科研服務(wù)
科研產(chǎn)品
微信公眾號(hào)
微信視頻號(hào)
版權(quán)所有：南京康旭禾生物科技有限公司 蘇ICP備2021044455號(hào)-1
在線咨詢
聯(lián)系方式
聯(lián)系電話
19379182007
聯(lián)系電話
15579155056
掃一掃二維碼
