T細胞耗竭與膽固醇代謝的關系：或可應用于腫瘤免疫治療
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發表時間：2025-09-02
今天給大家帶來的這篇文章2023年5月發表在Cancer Cell上，論文標題為“Exhaustion-associated cholesterol deficiency dampens the cytotoxic arm of antitumor immunity”。中科院分子細胞科學卓越創新中心許琛琦團隊與武漢大學生科院宋保亮院士團隊合作，研究繪制了腫瘤微環境中膽固醇圖譜，揭示膽固醇缺乏驅動腫瘤微環境中T細胞耗竭和功能障礙的機制。通過CRISPR-Cas9敲除CAR-T細胞的LXRβ，能夠解除膽固醇缺乏導致的T細胞耗竭和功能障礙，從而顯著增強CAR-T的肝癌治療效果。
臨床問題
腫瘤微環境（TME）中存在各類免疫細胞：腫瘤浸潤淋巴細胞（TILs）可以識別并殺傷腫瘤細胞；髓系細胞，主要是腫瘤相關巨噬細胞（TAMs）和中性粒細胞，行使腫瘤促進和免疫抑制功能。T淋巴細胞進入腫瘤微環境后可能會發生耗竭和失能，清除腫瘤能力減弱。目前研究發現造成T細胞耗竭和失能的原因有：其一是慢性抗原刺激，其二是腫瘤微環境引發T細胞代謝變化。
腫瘤微環境中的營養限制是導致腫瘤細胞免疫逃避的重要因素。葡萄糖是研究廣泛的腫瘤微環境營養限制因素，其他必需營養素的重要性也在逐漸得到認識。膽固醇作為細胞膜結構（包括質膜）的重要組成部分，對細胞增殖至關重要。癌細胞通常通過激活SREBP2信號來上調膽固醇的生物合成和攝取，以獲得足夠的增殖基礎?；谝种颇懝檀极@取來抑制腫瘤細胞增殖這一理論，降膽固醇藥物——他汀類藥物，通過抑制膽固醇生物合成中的限速酶HMG-CoA還原酶，用于癌癥治療。
然而其實際益處并不大，因為腫瘤微環境中各類細胞的膽固醇水平、實際效應以及腫瘤細胞與免疫細胞是否存在膽固醇競爭仍未知，僅僅靶向腫瘤細胞降低其膽固醇水平容易忽視對其他類型細胞的影響。因此，需要仔細評估臨床測試使用的靶向膽固醇代謝藥物對不同類型免疫細胞有益或有害的作用。對此，我們仍需把目光放到腫瘤微環境全局而非僅局限于腫瘤細胞。
小知識細胞的膽固醇代謝主要受兩個關鍵轉錄因子SREBP2和LXR調控：SREBP2通過調控膽固醇生物合成和攝取基因來上調細胞膽固醇水平；LXR通過調控膽固醇外排和抑制膽固醇攝取基因來下調膽固醇水平。
研究內容
為了解腫瘤微環境中淋巴細胞膽固醇水平變化，以及嘗試對其干預觀察能否增強抗腫瘤功能，本篇文章對以下兩個方面進行全面而詳細的探究：查看腫瘤微環境的膽固醇圖譜→ 鎖定CD8+ T細胞會因膽固醇缺乏而丟失 → 了解CD8+ T細胞對膽固醇需求特性 → 膽固醇缺乏誘導CD8+ T細胞自噬介導的凋亡 → TME中膽固醇缺乏引發T細胞耗竭機制 → LXR抑制的抗腫瘤作用
①腫瘤微環境的膽固醇圖譜
在小鼠B16F10腫瘤和人肝癌腫瘤組織中，通過ALOD4-AF647染色測定質膜膽固醇水平，通過測量活細胞吸收熒光標記脂蛋白的能力測定不同細胞群的膽固醇攝取水平。發現腫瘤浸潤淋巴細胞具有較低的膽固醇水平和膽固醇攝取能力。
進一步確認TILs低膽固醇水平的特殊表現，通過過繼轉移實驗比較不同刺激對T細胞膽固醇水平的影響，發現腫瘤浸潤性OT-I T細胞的膽固醇水平遠低于疫苗激活的OT-I T細胞，甚至低于從未受活性抗原刺激的腫瘤小鼠分離的脾OT-I T細胞。這些數據共同表明，TME可以導致TILs中的膽固醇缺乏。
②膽固醇缺乏會導致腫瘤微環境中CD8+ T細胞丟失
使用ScapCKO小鼠模型-特異性從T細胞中去除SCAP（SREBP2的激活蛋白），抑制膽固醇的獲取。移植MC38結直腸癌細胞后檢測TME，發現CD8+ T細胞數量減少，CD4+ T細胞和Treg數量未受影響。對數量減少的PD-1+ CD8+ T 細胞類群進行RNA sequencing，發現細胞增殖分化相關通路、細胞周期通路表達下調。
③CD8+ T比CD4+ T細胞更積極參與膽固醇獲取
兩種細胞針對SCAP缺失的反應不一樣，受影響更大的說明更依賴膽固醇。通過測量兩種細胞的膽固醇代謝和相關通路：FCM +ALOD4探針測量PM cholesterol水平、擴張速率；[14C]acetate pulsing測膽固醇從頭合成比例、脂蛋白攝取速率、膽固醇合成和攝取通路中關鍵蛋白的表達（SREBP2&LXR）、細胞核SREBP2水平、AKT和mTORC1通路水平、ACSS2膽固醇合成起始酶水平。發現CD8+T細胞攝取利用膽固醇更高，且驗證了AKT-mTORC1-SREBP2信號通路在CD8+ T細胞中驅動更活躍的膽固醇獲取，通路和膽固醇可以形成一個前饋回路。
④CD8+ T比CD4+ T細胞更易受膽固醇缺乏影響
基于兩種細胞膽固醇代謝的不同，來查看在膽固醇缺乏時在細胞增殖和細胞存活方面的反應如何。通過基因干預（Scap KO、Ldlr KO）、藥理干預（lovastatin→抑制近端酶 HMGCR / Ro 48-8071→抑制遠端酶 OSC）發現，膽固醇缺乏對CD8+T的增殖抑制較強，并且導致更多細胞死亡。
⑤膽固醇缺乏誘導CD8+ T細胞自噬介導的凋亡
接下來查看CD8+ T細胞是何種死亡類型。膽固醇缺乏時，檢測到了細胞凋亡、細胞自噬特征：capase3/PARP分裂、DNA碎片、核斷裂；ULK1磷酸化降低、LC3b成熟；mTORC1不活躍。進行上游-添加膽固醇/下游-凋亡抑制劑和自噬抑制劑功能挽救實驗發現，上游的功能挽救更有效：上游干預激活mTORC1，下游干預僅僅阻止caspase-8-caspase-3-PARP激活。比較兩種細胞的自噬表型，CD8+ T細胞更顯著。
到此為止，文章確認了TME中CD8+ T細胞膽固醇缺乏，了解CD8+ T細胞對膽固醇需求特性及缺乏后果。那么，在TME中CD8+ T細胞膽固醇缺乏的機制是什么呢？
⑥在耗竭T細胞中，SREBP2和LXR通路的發生改變
Ⅰ）確定引發T細胞內膽固醇水平改變的因素和相關通路
使用動物模型（Huh7異種移植瘤+GPC3.BBZ CAR-T過繼移植）和細胞模型（Huh7和CAR-T細胞共培養），通過bulk RNA sequencing 和 RT-qRCR驗證發現，SREBP2通路水平↓和LXR通路水平↑。由于甾醇代謝物如氧化甾醇可以直接調節SREBP2和LXR活性，甾醇組學來測量Huh7 細胞培養基中的甾醇代謝物發現，培養基含有的27-羥基膽固醇（27-HC）是LXR的一種強效激動劑，也可以與INSIG結合，抑制SREBP2的易位和激活。
Ⅱ）SREBP2/LXR信號通路和代謝途徑的改變，驅動T細胞耗竭或功能障礙
使用SREBP2通路抑制劑 (lovastatin or Ro 48-8071)、LXR 通路激活劑 (LXR agonist RGX-104 or GW3965)均能抑制CAR-T細胞增殖，CAR-T細胞膽固醇缺乏模型+處理（與腫瘤細胞共培養+抑制劑/激活劑）下，進行bulk RNA seq，LXR↑&SREBP2↓通路改變下調了缺氧/糖酵解通路和mTORC1活性，上調了干擾素反應。缺氧反應促進CD8+ T細胞的抗腫瘤效應功能和組織駐留，膽固醇缺乏導致的缺氧反應下調會減弱抗腫瘤免疫并使T細胞在缺氧腫瘤微環境中易受攻擊。糖酵解通路和mTORC1活性下調會抑制T細胞合成代謝與能量生成，影響細胞分化和存活。上調的干擾素反應會驅使T細胞耗竭，降低ICB療效，并可能進一步下調T細胞膽固醇水平。
因此，氧甾醇介導的膽固醇水平下降驅使T細胞耗竭和功能失調，主要的代謝途徑和信號通路被揭示。且與慢性抗原刺激導致T細胞耗竭的機制（轉錄因子TOX/SOX4）不同。
⑦LXRβ缺失促進肝癌模型中CAR-T細胞活性
LXR通路基因在耗竭的T細胞中表達改變極大，選中LXR抑制的策略。篩選出LXRβ，敲掉后體內外驗證，并驗證安全性。
總結
文章系統性地研究了腫瘤微環境中T淋巴細胞的膽固醇代謝狀態，為進一步通過靶向膽固醇代謝治療腫瘤提供了理論基礎。除此之外，該研究可能也與其他涉及到T細胞膽固醇代謝的疾病相關。對于自身免疫和慢性炎癥，過度活化的T細胞會導致組織損傷，抑制膽固醇獲得可能通過抑制T細胞免疫來改善疾病進展。進一步的研究方向：
① 腫瘤微環境中其他免疫細胞類群的膽固醇水平以及對功能的影響；
② T細胞中膽固醇缺乏是如何導致干擾素反應上升的；
③ 只在肝癌模型中進行了膽固醇水平修正，在其他類型的癌癥中有待考察；
④ 膽固醇生物合成途徑的另一個產物-類異戊二烯的功能有待探究。
主營項目
1. 動物實驗
動物飼養、疾病造模、行為學檢測、心功能、無創血壓、血常規、全自動生化檢測等
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3. 分子生物學
PCR檢測、熒光定量PCR、絕對定量PCR、端粒酶長度、pull down、雙熒光素酶、SSR、SNP檢測等
4. 蛋白實驗
WB、Co-IP、酵母雙雜
5. 病理實驗
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6. 生理生化實驗
肝腎功能、抗氧化、免疫反應等生理免疫指標;動植物營養指標、微量元素、重金屬、酶活等。
7. 多組學實驗
基因組、轉錄調控、蛋白組、代謝組、微生物多樣性、宏基因組、生信分析
8. 整體課題實驗
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