【細胞實驗干貨分享】細胞凍存與復蘇常見問題及解決方法
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發表時間：2025-07-25
細胞凍存和復蘇是在細胞研究和生物醫學領域中常見的實驗技術，用于長期保存和重復使用細胞。
細胞凍存與復蘇常見問題
1. 細胞存活率低：有時，在冷凍和復蘇過程中，細胞的存活率可能會較低
① 確保使用新鮮和健康的細胞進行凍存。
② 控制好細胞密度，在適當范圍內進行冷凍。
③ 使用合適的凍存液和冷卻速率。
④ 在復蘇過程中盡快進行快速復蘇，并采用溫和的解凍方法。
2. 細胞凍存為什么要添加保護劑?
細胞凍存是將細胞放在低溫環境，減少細胞代謝，以便長期儲存的一種技術，細胞在不加任何保護劑的情況下冷凍，細胞內外的水分會很快形成冰晶從而引發一系列的不良反應：
首先，部分蛋白質因局部電解質濃度增高和pH值改變而變性，導致細胞內部空間結構發生改變。
其次，細胞內冰晶的形成和細胞膜系統上蛋白質，酶的變性等會限礙細胞的能量代謝。再次，胞膜上的類脂蛋白復合體在冷凍中易發生破壞引起胞膜通透性的改變，使細胞內容物喪失。
最后，隨著冷凍溫度的降低，冰晶體積膨脹造成DNA的空間結構發生損傷從而引起細胞死亡。
添加冷凍保護劑可以很好的改善細胞的破壞與死亡情況。
3. 冷凍管應如何解凍?
從液氯中取出細胞置-80℃冰箱中數分鐘，讓管中液氛揮發后，再放入37℃的水
浴鍋中(預防凍存管爆裂)，輕搖凍存管使其最好在2min內全部融化，并注意水面不可超過凍存管管口，否則容易造成污染。
4. 冷凍管或容器標記丟失或模糊，導致樣本識別困難。
在冷凍之前，確保正確標記凍存管或容器上的樣本信息，并記錄詳細的細胞類型、凍存液組分和處理步驟等信息。
使用耐久性好的標記方法，如抗水消融墨水或永久性標簽。
5. 高效進行細胞凍存應該注意什么?
① 緩慢冷凍：慢凍可使細胞逐步脫水，細胞不會因產生大的冰晶而受到損害。相反，細胞內若出現大結晶會引起細胞膜、細胞器的損傷和破裂。
② 細胞活力及濃度：細胞應在生長良好、致密度約為80-90%活力達90%以上的狀態下凍存。細胞活力差的細胞在凍存后的成活率很小，因此，一定要在細胞旺盛分裂時期凍存。
③ 凍存密度：凍存時細胞密度少于5x105個活細胞/mL時，很難成功復蘇。
④ 凍存管蓋子：凍存管的蓋子一定要擰緊，否則水浴復蘇時水會滲入造成污染。
⑤ 凍存時間：細胞不可長期保存在-80℃冰箱中。我們建議在-80℃冰箱中的保存時間不要超過48h。
6. 細胞凍存和復蘇的最佳時間是什么時候?
細胞在體外生長期間，通常分為三個階段:潛伏期、指數生長期和平臺期。潛伏期通常是細胞剛剛傳代，此時細胞開始貼附基質和伸展骨架，代謝活動集中在粘附蛋白和骨架蛋白的表達，細胞量在這段時間內幾乎沒有增加。
隨后，細胞開始指數生長期，核酸轉錄翻譯旺盛，DNA解旋、配對頻繁，胞內物質傳遞迅速，細胞數量迅速增長。如果在這個時期凍存，實際上是強行將細胞凍結在代謝的某一時刻，勢必造成對解旋的DNA、轉錄翻譯中的RNA和蛋白的機械損傷，增加個別環節發生錯誤的風險。
隨著細胞數量的增長，培養容器內，細胞匯合達到90%以上。大部分細胞因為“接觸抑制”而停止高速代謝和增殖，胞內活動趨于平緩。
所以，我們建議在剛剛進入平臺期時凍存細胞，既可以獲得足量的細胞，也不會對細胞造成過多的機械損傷。
7. 細胞解凍后不適應培養環境或缺乏活力。
解凍后立即將細胞轉移到預先準備好的培養基中。
逐漸稀釋細胞并適應新的培養環境。
定期檢測細胞的活力和功能狀態，并根據需要進行培養條件的優化。
8. 臨床手術切下來的腫瘤組織的凍存和復蘇應該怎么做?
不論是腫瘤組織、正常組織或細胞的凍存和復蘇需要把握的關鍵都是“慢凍快融”。
組織凍存中使用的“玻璃化液”和細胞凍存中使用的“凍存液”作用的本質都是結合或吸收細胞內的自由水，避免或減少細胞在冷凍過程中，胞內的自由水凝結為冰晶刺破細胞。
通常，環境溫度在-5~-10℃之間時，細胞內開始形成冰晶。快速的冷凍會加劇冰晶的形成，所以，我們在凍存細胞時會使用程序降溫儀，含異內醇的程序降溫盒或者特質的泡沫盒。這些儀器、設備、試劑的使用都是為了減緩細胞冷凍速度。
至于復蘇，我們一般是在37℃水浴鍋中震蕩，讓細胞、組織迅速度過“冰晶危險期”。
9. 細胞在液氮中可以保存多久?
細胞凍存可以使細胞暫時脫離生長狀態而將其細胞特性保存起來，細胞儲存在液氮中，溫度達-196℃，理論上儲存時間是無限的。
為妥善起見，特別是很多未被凍存過的細胞在首次凍存后要在短期內復蘇1次，觀察細胞對凍存的適應性。已建系的細胞最好也每年復蘇1次后，再繼續凍存。
細胞凍存與復蘇注意事項
1. 細胞凍存注意事項
① 選擇適合的凍存液：根據細胞類型選擇合適的凍存液，常用的包括含有冷凍保護劑（如DMSO、甘油）的培養基或凍存液。DMSO配制的時候會放熱，一定要等凍存液冷卻后使用，避免灼傷細胞。
② 細胞密度控制：要控制好細胞的密度，避免過度或不足密度冷凍。通常，細胞密度應該在適當的范圍內，以確保細胞在冷凍和復蘇過程中的存活率。細胞離心后盡量吸干凈上清液，減少培養基殘留，避免稀釋凍存液；
③ 不建議手動梯度降溫，溫度不穩定，容易降低存活率；
④ 注意程序降溫盒內異丙醇的量必須高于最低刻度線；凍存5次后異丙醇需要更換一次，以免影響凍存效果；程序降溫盒需恢復到室溫以后才能繼續使用，不能從冰箱拿出來直接使用；
⑤ 細胞懸液加入凍存液以后盡量短時間的在常溫放置，DMSO常溫下對細胞損傷大，分裝完成后立即轉入程序降溫盒放到-80度冰箱，不需要放4度；
⑥ 使用適當的冷凍容器和方法來實現較快的冷卻速率，以避免冰晶形成對細胞造成的損傷。常見的方法包括使用液氮浸泡法或冷凍慢冷器。-80度凍存過夜后可以轉入液氮長期保存，轉入液氮的過程需要對凍存盒進行保冷，不要長時間在常溫暴露，避免凍存管融化；
⑦ 若沒有液氮罐，存放在-80度的時候一定要放靠里面的位置，避免開關冰箱導致溫度不穩定。
⑧ 細胞凍存后應取出一管復蘇，檢測細胞的存活率。理論上細胞可在液氮內長期保存，為穩妥起見可在細胞凍存半年后復蘇培養，觀察細胞生長情況，再繼續凍存；
⑨ 由于沒有使用凍存盒，在轉入液氮的過程中一定要對凍存管做好保冷措施，不能直接用手拿，可以用干冰或者少量液氮保護后轉移，操作過程注意安全；
⑩ 轉移過程要快，避免凍存管暴露于常溫后融化；若沒有液氮罐，存放在-80度冰箱的時候一定要放靠里面的位置，避免開關冰箱導致溫度不穩定。
2. 細胞復蘇注意事項
① 水浴鍋的位置如果與液氮罐不是一個房間，需要對凍存管進行保冷后轉移到水浴鍋旁，避免路途細胞表面融化；盡量迅速將凍存管或容器從液氮中取出，并立即將其置于37°C的水浴中進行快速復蘇。
② 溫和解凍：使用適當的方法解凍細胞，如將凍存管放入37°C的水浴中直至完全解凍。避免使用高溫或暴露時間過長的方法，以免對細胞造成熱傷害。
③ 細胞溶解過程快速搖晃以加速溶解。
④ 已溶解的凍存細胞盡量短時間的在常溫存放，盡快離心去除DMSO。
⑤ 貼壁細胞復蘇24小時后觀察，若密度達到80%，則正常傳代；若密度不到80%則繼續培養到48小時再換液。
⑥ 稀釋和培養：在解凍后，立即將細胞轉移到預先準備好的培養基中，逐漸稀釋并適應新的培養環境。控制好培養基的溫度和含有適當的營養物質。
⑦ 懸浮細胞復蘇3天內不建議離心換液。
⑧ 對DMSO不敏感的細胞在復蘇時也可不離心，減少操作步驟，也可降低污染的幾率。將解凍的細胞懸液直接轉移至T25細胞瓶內，補加新鮮培養基，放入溫箱內培養。
以上解決方案提供了一些常見問題的應對方法。然而，不同的細胞類型和特殊的實驗條件可能會有不同的具體情況和解決方案。
因此，在進行細胞凍存和復蘇操作之前，最好參考相關文獻、咨詢領域專家，以獲得更具體和準確的指導。
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