qPCR擴增曲線與Ct值解讀
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發表時間：2025-07-30
在熒光定量 PCR（qPCR）技術中，qPCR 擴增曲線與 Ct 值（或Cq值）是理解和分析實驗結果的核心要素。它們就像一把鑰匙，為我們解鎖基因表達量的秘密，在生命科學研究和臨床診斷等領域發揮著至關重要的作用。
qPCR通過熒光染料或探針與擴增的雙鏈DNA結合，產生熒光信號。機器實時監測熒光信號變化，反映DNA擴增的數量。通過分析熒光信號的強度，可以定量分析樣品中的目標基因。PCR指數擴增過程當中，產物量與循環數之間的關系是：擴增產物量f(x)=起始模板量S×（1+E）^循環個數n。
2、什么是擴增曲線
定義：擴增曲線是描述PCR動態進程的曲線，以循環數為橫坐標，以反應過程中實時熒光信號強度為縱坐標。擴增曲線可以分成四個時期：基線期，指數期，線性期，平臺期。
擴增曲線常以線性圖譜和對數圖譜兩種形式展現。
線性圖譜：以 PCR 循環數為橫坐標，熒光信號強度為縱坐標，直接呈現熒光信號隨循環數增加的變化情況。
對數圖譜：以 PCR 循環數為橫坐標，熒光信號強度的對數為縱坐標，突出指數增長期的特征，此階段曲線會呈現為一條直線。
對數圖譜
線性圖譜
2、什么是CT值（Cq值）
定義： PCR擴增過程中，擴增產物的熒光信號達到設定的熒光閾值時的所對應的擴增循環數（Cycle Threshold）。C代表Cycle，T代表Threshold。
閾值（threshold）：在擴增曲線的指數增長區域內，選擇任意適當位置設定的熒光檢出界限。
熒光閾值一般由儀器自動設置，也可以手動設置。熒光域值閾值線的缺省設置通常是PCR擴增前3-15個循環的熒光信號標準偏差的10倍。
同一次反應中對于不同的基因可單獨設置閾值，但對于同一個基因擴增一定要設置相同的閾值。
3、為什么要有CT值
3.1Ct值具有重現性：同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內擴增，得到的Ct值是恒定的。
注：模板為10^5k拷貝GAPDH，用GAPDH引物擴增。96個孔重復結果的Ct平均值為19.1，變異系數（Cv）=0.002. 3.2Ct值與起始模板的線性關系：由于Ct值與起始模板的對數存在線性關系，可利用標準曲線對未知樣品進行定量測定。
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