動物疾病模型主要用于實驗生理學、實驗病理學和實驗治療學(包括新藥篩選)研究。人類疾病的發展十分復雜,臨床積累的經驗不僅在時間和空間上都存在局限性,而且在方法和道義上也受到限制。借助于動物模型的間接研究,可以有意識地改變那些在自然條件下不可能或不易排除的因素,以便更準確地觀察模型的實驗結果并與人類疾病進行比較研究,有助于更方便,更有效地認識人類疾病的發生發展規律,研究防治措施。
1.方案設計
01
常用動物實驗選擇
1. 名 稱:KM 小鼠
主要用途:廣泛應用于藥理學、毒理學等領域研究以及藥品、生物制品的生產與檢定。
簡 介:1926年美國Rockfeller研究所從瑞士引入白化小鼠培育成Swiss小鼠。1944年3月17日由湯飛凡教授從印度Hoffkine研究所引進Swiss小鼠,飼養在昆明中央防疫處。由于該小鼠起初引入地是昆明,故稱之為昆明小鼠。解放后中央防疫處遷回北京天壇,更名為衛生部生物制品研究所。1950年小鼠隨之引到北京天壇(檢定所現址),當時保種9對。1953年10月移至北京東郊,1954年擴種,相繼引到其他單位,現已遍布全國各地。
特 點:遠交系小鼠,經50多年的選育,現在KM小鼠腫瘤自發率極低。不同地飼養的昆明小鼠封閉群的生長發育與繁殖性能存在一定差異。但其共同特點是抗病力和適應力很強,繁殖率和成活率高。它在我國生物醫學動物實驗中約為小鼠總用量的70%。
2. 名 稱:ICR小鼠
主要用途:已選為某些生物制品檢定的法規動物。廣泛用于藥理、毒理、腫瘤、放射性、食品、生物制品等的科研、生產和教學。
簡 介:中國科學院遺傳研究所在1973年從日本國立腫瘤研究所引進;1979中國醫學科學院分院動物中心引進;1978年北京檢定所引進;1983年上海計劃生育研究所從瑞士蘇黎世毒理學研究所引進。
特 點:遠交系小鼠,毛色白化。適應性強,體格健壯,繁殖力強,生長速度快,實驗重復性較好,雌鼠自發性畸胎瘤和管狀腺瘤發病率為0%~1%,用氨基甲酸乙酯誘發時,11~16天胚胎期畸胎瘤和管狀腺瘤發病率為5.9%,離乳個體管狀腺瘤和囊瘤發生率為30%,孕鼠為3%。是國際通用的封閉群小鼠, 我國從美國、日本、英國、瑞士等國引進的ICR,各群體之間在遺傳特性方面不可避免地出現了一些差異,在應用時應注意。ICR/JCL小鼠是進行免疫藥物篩選,復制病理模型較常用的實驗動物。外周血象和骨髓細胞,具有較好的穩定性,是良好的血液學實驗用動物。
3. 名 稱:C57BL/6J小鼠
主要用途:常被認作“標準”的近交系,為許多突變基因提供遺傳背景。是腫瘤學、生理學、免疫學、遺傳學研究中常用的品系。
簡 介:1921年立特(Little)用艾比·拉特洛坡(Abby Lathrop)的小鼠株,雌鼠57號與雄鼠52號交配而得C57BL1937年從C57BL分離出C57BL/6和C57BL/10兩個亞系。1985 年從Olac引到中國醫學科學院實驗動物研究所。
特 點:近交系小鼠,毛色黑色;補體活性高;較易誘發免疫耐受性;對結核桿菌敏感;干擾素產量高。是腫瘤學、生理學、免疫學、遺傳學研究常用的品系。乳腺腫瘤自然發生率低,化學物質難以誘發乳腺和卵巢腫瘤。12%有眼睛缺損;雌仔鼠16.8%,雄仔鼠3%為小眼或無眼。用可的松可誘發腭裂,其發生率達20%。對放射物質耐受力中等;補體活性高;較易誘發免疫耐受性。對結核桿菌敏感。對鼠痘病毒有一定抵抗力。干擾素產量較高。嗜酒 精性高,腎上腺素類脂質濃度低。對百日咳組織胺易感因子敏感。
4. 名 稱:BALB/c小鼠
主要用途:廣泛地應用于腫瘤學、生理學、免疫學、核醫學研究,以及單克隆抗體的制備等。但對致癌因子敏感。肺癌發病率雌性26%,雄性29%。對放射性照射極為敏感。廣泛應用于腫瘤學、生理學、免疫學、核醫學和單克隆抗體等研究中。
簡 介:1913年,貝格(Bagg)從美國商人歐希爾(Ohio)處購得的白化小鼠原種,以群內方法繁殖。麥克·多威爾(MacDowell)在1923年開始作近交系培育,至1932年達26代,命名為BALB/c品系。安德爾文特(Andervont)等人使BALB/c廣為傳播和應用。1985年我國從美國NIH引進到中國醫學科學院實驗動物研究所,為BALB/c第180代。
特 點:乳腺腫瘤自然發生率低,但用乳腺腫瘤病毒誘發時發病率高;卵巢、腎上腺和肺的腫瘤在該小鼠有一定的發生率。易患慢性肺炎。對放射線甚為敏 感。與其他近交系相比,肝、脾與體重的比值較大。20月齡的雄鼠脾臟有淀粉樣變。有自發高血壓癥,老年鼠心臟有病變,雌雄鼠均有動脈硬化。對鼠傷寒 沙門氏菌補體敏感,對麻疹病毒中度敏感。對利什曼原蟲屬、立克次氏體和百日咳組織胺易感因子敏感。
5. 名 稱:BALB/c-nu裸鼠
主要用途:廣泛應用于腫瘤學、免疫學、毒理學等基礎醫學和臨床醫學的研究。
簡 介:1973年丹麥的C.W.Friis在BALB/cA近交系小鼠中發現自發性突變的無毛小鼠,該突變小鼠胸腺發育不良,免疫T細胞缺失,而培育成了BALB/cA-nu。
特 點:無毛、裸體、無胸腺。隨著年齡增長,皮膚逐漸變薄、頭頸部皮膚出現皺折、生長發育遲緩。由于無胸腺而僅有胸腺殘跡或異常胸腺上皮(該上皮不能使T細胞正常分化),導致缺乏成熟的T淋巴細胞,因而細胞免疫功能低下。但6~8周齡裸小鼠的NK細胞活性高于一般小鼠。B淋巴細胞正常,但其免疫功能欠佳。表現在B淋巴細胞分泌的免疫球蛋白以lgM為主,僅含少量的IgG。抵抗力差,容易患病毒性肝炎和肺炎。因此必須飼養在屏障系統中。為了提高繁殖率和存活率,一般采用純合型雄鼠與雜合型雌鼠交配的繁殖方式,可以獲得1/2純合型仔鼠。常用裸小鼠品系:BALB/c-nu、NIH-nu、NC-nu Swiss-nu、03H-nu、C57BL-nu等。
6. 名 稱:WISTAR大鼠
主要用途:多用于腫瘤、免疫、藥理、內分泌。
簡 介:1907年由美國維斯塔爾(Wistar)研究所育成,現己遍及世界各國的實驗室。我國從日本及前蘇聯引進,是引進最早、使用最廣泛、數量最多的大鼠品系之一。
特 點:遠交系大鼠,頭部較寬、耳朵較長、尾的長度小于身長。性周期穩定,繁殖力強,產仔多,平均每胎產仔在10只左右,生長發育快。10周齡時雄鼠體重可達 280~300g,雌鼠達170-260g。性情溫順。對傳染病的抵抗力較強。自發性腫瘤發生率低。目前各地飼養的Wistar大鼠的遺傳狀況差異較大。
7. 名 稱:SD(SpragueDawley)大鼠
主要用途:廣泛用于藥理、毒理、藥效及GLP實驗,營養學及內分泌系統的研究。
簡 介:1925年,美國斯潑累格。多雷(SpragueDawley)農場用Wistar大鼠培育而成。生長快,繁育性能好,大多用于安全性試驗及營養與生長發育有關的研究。
特 點:頭部狹長、尾長接近于身長,產仔多,生長發育較Wistar為快。10周齡時雄鼠體重可達300~400g,雌鼠達180~270g。性情比Wistar大鼠稍為兇猛。對疾病的抵抗力較強,尤其對呼吸道疾病的抵抗力很強。自發性腫瘤的發生率較低。對性激素敏感性高。
02
實驗設計基本原則
1. 隨機原則
即運用“隨機數字表”實現隨機化;運用“隨機排列表”實現隨機化;運用計算機產生“偽隨機數”實現隨機化。盡量運用統計學知識來設計自己的實驗,減少外在因素和人為因素的干擾。
2. 對照原則
空白對照組的設立——只有通過對照的設立我們才能清楚地看出實驗因素在當中所起的作用。當某些處理本身夾雜著重要的非處理因素時,還需設立僅含該非處理因素的實驗組為實驗對照組;歷史或中外對照組的設立一一這種對照形式應慎用,其對比的結果僅供參考,不能作為推理的依據;多種對照形式同時并存。
3. 重復原則
所謂重復原則,就是在相同實驗條件下必須做多次獨立重復實驗。一般認為重復3次以上的實驗才具有較高的可信度。
2.實驗操作
01
小鼠的抓取固定
1. 小鼠的抓取
(1)右手提起小鼠尾巴,將其放在鼠籠蓋或其他粗糙表面上
(2)小鼠向前掙扎爬行時,再用左手拇指和食指抓住鼠耳和頸部皮膚(如下圖)
抓取固定時需注意 : 過分用力 , 會使動物窒息或頸椎脫臼 ; 用力過小 , 動物頭部能反轉來咬傷實驗者的手。因此實驗者必須反復練習 , 熟練掌握。
2. 小鼠的固定
(1)徒手固定
用右手抓取鼠尾提起,置于鼠籠或實驗臺向后拉,在其向前爬行時,用左手拇指和食指抓住小鼠的兩耳和頸部皮膚,將鼠體置于左手心中,把后肢拉直,以無名指按住鼠尾,小指按住后腿即可。
(2)固定板固定
鼠麻醉后置小鼠固定板上,取仰臥位, 用膠布纏粘四肢,再用針透過膠布扎在板上,從而將小鼠固定在小鼠固定板上。
(3)固定架固定
讓小鼠直接鉆入固定架里, 封好固定架的封口, 露出尾巴。此裝置特別適用于小鼠尾靜脈注射等。
02
大鼠的抓取固定
大鼠的抓取斯基本同小鼠,只不過大鼠比小鼠牙尖性猛,不易用襲擊方式抓取,否則會被咬傷手指,抓取時為避免咬傷,可帶上帆布手套。
如果進行腹腔、肌肉皮下等注射和灌胃時,同樣可采用左手固定法,只是用拇指和食指捏住鼠耳,余下三指緊捏鼠背皮膚,置于左掌心中,這樣右手即可進行各種實驗操作。也可伸開左手之虎口,敏捷地從后,一把抓住。
若做手術或解剖等,則需事先麻醉或處死,然后用細棉線繩活縛腿,背臥位綁在大鼠固定板上;尾靜脈注射時的固定同小鼠(只需將固定架改為大鼠固定盒即可)。
注意事項:
為了減少或避免大鼠在實驗中發生的應激反應,以減少對實驗者的攻擊損傷,這里介紹幾種抓取大鼠的技巧改進:
(1)在抓取前可用一條清潔的毛巾蒙住大鼠全身,大鼠處于黑暗狀態下神經會有所放松,看不到實驗者的動作也會降低對實驗者的攻擊機會;
(2)一般抓取大鼠都會抓住尾巴,但是有時大鼠尾巴不在身后而在其面前,這時實驗者可能在抓取鼠尾的時候被大鼠攻擊。這種情況一般可以輕推其腰臀部,使之變換姿勢,待鼠尾調整到身后再進行抓取;
(3)由于大鼠尾部被抓起時,會應激性地排便、排尿,所以最好在粗糙表面上墊上報紙等,做好防范措施,減輕工作量。
3.動物給藥方法
在動物實驗中,為了觀察藥物對機能功能、代謝及形態引起的變化,常需將藥物注入動物體內。給藥的途徑和方法是多種多樣的,可根據實驗目的、實驗?動物種類和藥物劑型等情況確定。實驗動物常見的給藥方式有:口服、靜脈注射、腹腔注射、皮下注射、肌肉注射、椎管內注射、腦室內注射、皮內注射、淋巴腔注射、鼻腔和舌下給藥等多種。
01
灌胃法
小鼠灌胃方法比較簡單,需要關注的只有兩點:一是要保持小鼠的頭部和頸部成一直線,方便灌胃針頭進入,二是動作要輕柔,從口角進入,防止損失食道。
操作步驟:
1. 抓住小鼠,使其頭、頸和身體呈一直線。
2. 用1 ml的注射器配灌胃針頭。灌胃針頭從小鼠的嘴角進入,壓住舌頭,抵住上顎,輕輕向內推進,進入食管后會有一個刺空感,進入食道后就可以推注藥液。
3. 灌胃容積一般是0.1~0.2 ml/10 g,最大0.35 ml/10 g,每只小鼠的灌胃最大容積不超過0.8 ml。
經驗總結:
1. 在操作過程中最重要的是小鼠的固定,注意頭一定要固定好,頭和軀體要保持一條直線,并且灌胃時使小鼠成豎直位,頭向上。
2. 把握要領,動作盡量迅速,減少小鼠的不適感。
3. 小鼠灌胃劑量:0.1 ml/10 g體重:一只20 g的小鼠,一般一次灌胃0.2 ml。
4. 操作前將灌胃針安在注射器上大致測量一下從口腔到胃內的位置(最后一根肋骨后緣)的長度,根據此距離確定插入深度,成年小鼠插入大約3厘米。
5. 固定好小鼠,身體最好伸展在一條直線,太松會動,太緊就把小鼠脖子勒住了。一般沿口角進針,抵達咽部會有抵觸感,小鼠會有吞咽動作,此時阻力喪失,可繼續下行。
02
腹腔注射
腹腔注射雖然簡單,也有翻車的危險。一針下去,扎到內臟,嗚呼哀哉。先將小鼠腹腔注射操作要點總結如下:
抓鼠后選擇低尾高位的體位;
選擇下腹部腹中線進針;
小于60度進針有落空感;
回抽未見血后推針,旋轉半圈拔針。
腹腔注射適合刺激性小的水溶性藥物的用藥,利用腹腔膜及大小網膜血管豐富,吸收面積大等特點,使藥物快速入血。
操作步驟:
1. 抓取小鼠
一般都是放在飼養籠上,提其尾巴中部,水平偏下往后輕拉,小鼠爪子會自然會抓住籠子,此時應該迅速抓住小鼠的頸背部的皮毛,最好是抓在小鼠的耳朵處,這樣可以更好固定小鼠的頭部,以防被咬。但是,切記力氣不要過大,容易使小鼠窒息。
再將小鼠的尾巴用左手無名指或小拇指固定,這樣就可以將小鼠整個軀干固定好,注意一定要讓小鼠處于一個舒服的體位,如果小鼠軀干不能保持豎直,很容易扎到臟器,引起出血,影響實驗。
2. 注射
抓取小鼠后,應腹部向上,頭呈低位。頭呈低位可以使得臟器移至低位,避免扎傷。右手持注射器,插入小鼠腹部,注射部位為小鼠后肢根部連線處任一側1.5cm處,緩慢以45度左右進針,進針深度小于1cm,進針的感受為局部皮膚凹陷消失和落空感。
3. 拔針:為了防止漏液,輕微旋轉針頭,再緩緩拔出。
在實驗前,準備酒精棉球,注射器在使用后要消毒才能給下一只小鼠使用,避免交叉感染。此外,注射前,也可以用酒精棉球擦拭小鼠皮膚,可以明顯辨別藥物是否注射到腹腔,如果看到鼓包,就是注射到皮下了。
注意事項:
1、腹腔注射只宜用等滲藥液(如5%葡萄糖液、0.9%生理鹽水)適當配無刺激性的藥物(如肌苷、維生素B1、維生素C),而且注射量不宜太大,注射藥液溫度應與體溫相近。
2、注射時,小鼠頭部要呈低位,使內臟向胸部側偏移,針頭不宜過長,以防止刺傷腸道、膀胱或其它內臟器官。
3、進針時不要猶豫,切勿為避免刺傷器官,針頭剛插入皮膚就向上挑起,此時針頭極有可能還沒刺破腹腔壁,只是將液體注射在腹部皮下。
03
靜脈注射
稍微有點難度,沒有指導的話,一開始可能會感覺有點手足無措。但是可以肯定的說,只要掌握了方法,小鼠的尾靜脈注射還是很容易的。
操作步驟:
1. 固定小鼠最簡單的固定方法就是把小鼠放在盒子里面,讓它的尾巴伸在盒蓋的外面,用手抓住小鼠尾巴,輕輕往外拽,就可以固定好小鼠了。還有的固定方法就是用一個小的圓筒,圓筒的一段有個蓋子可以拿下來,蓋子中間有個小孔,可以讓小鼠的尾巴伸出來。
2. 固定好小鼠后就是注射了,一般用一次性的1ml的注射器就可以了,玻璃 的1ml的注射器也可以,針頭用4號(或胰島素針)。
3. 注射前首先要讓小鼠的血管充盈。可以采用75%的酒精棉球擦拭的方法或者采用溫水浸泡的方法。若小鼠的血管很不清楚,推薦采用溫水浸泡的方法,水溫以不燙手為宜。溫水浸泡2~3分鐘后,取出小鼠尾巴,用干棉球擦拭。等一會兒,待血管充盈后,酒精棉球擦拭后就可以進針了。若血管還不充盈,可以反復用溫水浸泡,切不可冒險注射。
4. 小鼠尾部共有四條血管,一般認為左右的兩條靜脈比較容易注射,多采用這兩條靜脈進針。一般要求進針部位靠近小鼠的尾端,這樣若注射失敗的話,還可以再向上選擇進針點。但是進針部位也不可以太靠下,因為越往下,靜脈越細,操作越難,一般以小鼠尾巴下三分之一的位置比較好。
5. 最關鍵的就是進針。進針時操作者左手食指和拇指固定住小鼠的尾巴,讓小鼠的尾巴在經過拇指后向下彎曲,進針點靠近拇指指甲。針頭和血管呈約30°角,針尖斜面朝上,輕輕挑刺入皮膚后針頭立即和血管平行,一般情況下一次就可以進入血管,可以將針頭刺入血管一大半,左右輕輕晃動針頭,確定針頭在血管內,就可以推注藥液了,正常情況下,推注的過程應該沒有明顯阻力,血管也不會鼓起。推液時動作宜輕柔,若發現血管鼓起,那是針頭沒有刺入血管,需立即拔出針頭。
注意事項:
1. 小鼠尾靜脈最重要的是小鼠一定要固定好;
2. 一開始最好從小鼠尾靜脈的末端開始注射,如果在中前端注射一旦失敗這樣可以防止注射的數次失敗后液體漏出;
3. 注射時手上的感覺很重要,如果針頭進入尾靜脈,手上會有一種透空感,這種感覺只有自己親自經歷后才會有比較深的體會,另外針頭如果進入后,液體的推射會很順利;如果,感覺液體推不進去,很費力,說明針頭沒有進入尾靜脈,而是進入了周圍的軟組織。
4. 在注射時,一個很重要的原則是注射要緩慢,均勻推射,速度不可以快,一旦速度快,小鼠會發生充血性心衰;如果一旦出現這種情況,立即停止注射,對小鼠實行心臟按摩;
5. 每次注射的劑量:不可以超過0.2毫升;注射劑量過多,也會發生充血性心衰
主營項目
1. 動物實驗
動物飼養、疾病造模、行為學檢測、心功能、無創血壓、血常規、全自動生化檢測等
2. 細胞實驗
CCK8/MTT、原代細胞分離、流式細胞實驗、細胞劃痕、侵襲、遷移、EDU染色、轉染、穩定株
3. 分子生物學
PCR檢測、熒光定量PCR、絕對定量PCR、端粒酶長度、pull down、雙熒光素酶、SSR、SNP檢測等
4. 蛋白實驗
WB、Co-IP、酵母雙雜
5. 病理實驗
HE染色、免疫組學、電鏡
6. 生理生化實驗
肝腎功能、抗氧化、免疫反應等生理免疫指標;動植物營養指標、微量元素、重金屬、酶活等。
7. 多組學實驗
基因組、轉錄調控、蛋白組、代謝組、微生物多樣性、宏基因組、生信分析
8. 整體課題實驗
方案設計、整體實驗交付、標書寫作、論文潤色、協助投稿
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