細胞焦亡研究方法匯總
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發表時間：2025-08-29
程序性細胞死亡(Programmed Cell Death, PCD)，是指細胞接受某種信號或受到某些因素刺激后，為了維持內環境穩定而發生的一種主動性消亡過程。凋亡、自噬、細胞程序性壞死、細胞焦亡都是是程序性死亡的表現形式。
細胞焦亡是一種最新發現的炎癥細胞程序性死亡方式，主要通過炎癥小體介導包含Caspase-1在內的多種Caspase的激活，造成包括GSDMD在內的多種Gasdermin家族成員發生剪切和多聚化，造成細胞穿孔，進而引起細胞死亡。相比于細胞凋亡（apoptosis），細胞焦亡發生的更快，并會伴隨著大量促炎癥因子的釋放。細胞焦亡在細胞形態學、生化特征以及基因水平上都與凋亡、自噬、鐵死亡、壞死等傳統的細胞死亡方式具有顯著的差異，目前有數種檢測細胞焦亡的方法，這篇文章將給各位概述目前常用的研究手段。
01
形態學變化
1. 倒置顯微鏡
從顯微鏡下觀察細胞焦亡時，可看到典型的膜泡狀結構（bubbles on the plasma membrane），這是由于細胞膜被穿孔，由于細胞內外滲透壓差異，細胞發生腫脹引起。從分子機制上來說，細胞焦亡的發生依賴于gasdermin（GSDMs）家族蛋白在細胞膜上打孔。打孔完成后，成熟的IL-1β和IL-18，還有其它的細胞內容物DAMPs，如 ATP, HMGB1, S100 proteins, and IL-1a 釋放出去，有別于細胞凋亡的炎癥過程產生。
2. 掃描電鏡如圖1所示，可以清楚看到在細胞質膜破裂前，焦亡的細胞形成大量小泡，即焦亡小體。之后細胞膜上會形成孔隙，細胞膜破裂，內容物流出。
圖1. Sham大鼠和急性胰腺炎大鼠胰腺腺泡細胞電鏡圖(×7000). A: Sham組大鼠正常的腺泡細胞, 細胞核完整, 細胞膜無破裂. B: 急性胰腺炎組大鼠焦亡的腺泡細胞, 胞內容物外溢, 細胞膜破裂, 細胞核固縮.
02
檢測焦亡相關蛋白
細胞焦亡的生化特征主要標志有炎癥小體的形成，caspase和gasdermin的激活以及大量促炎癥因子的釋放。
1. q-PCR/Western Blot方法檢測焦亡相關基因或蛋白的表達水平Western Blot： （1）Gasdermin D細胞焦亡發生時，Gasdermin D（GSDMD，53KD）被切割，產生30KD左右的片段，可以購買GSDMD一抗，用Western blot（WB）來驗證。 （2）Caspase-1、Caspase-4細胞焦亡發生時，caspase-1和caspase-4被激活，可以通過檢測caspase-1和caspase-4的活性來驗證。 
圖2. 檢測 H37Rv 和 H37RvΔEST12 感染巨噬細胞 caspase-1 和 GSDMD 活性，H37Rv?EST12 組與 H37Rv 組在感染后 1 小時內無明顯變化。在刺激 6h 后，H37Rv 在 BMDMs 中誘導了更多裂解的 caspase-1 p20 和 GSDMD-N 末端片段（圖 G）。在 BMDMs 中，與 BCG 相比 BCG-EST12 持續誘導更多的 caspase-1 p20 和 GSDMD-N 末端片段（圖 J）。
2. ELISA檢測IL-1β、IL-18等炎癥因子的水平
炎性細胞因子IL-1β和IL-18在細胞焦亡中經歷caspase-1依賴性激活和分泌。白介素-1β是一種有效的內源性熱原，可刺激發熱、白細胞組織遷移和多種細胞因子和趨化因子的表達。白細胞介素-18誘導干擾素γ的產生，對活化T細胞、巨噬細胞和其它細胞類型很重要。白細胞介素-1β和白細胞介素-18在一系列炎癥和自身免疫性疾病的發病機制中起著至關重要的作用。
ELISA 檢測 IL-1β分泌
03
TUNEL染色
DNA隨機降解，不像細胞凋亡時，DNA降解為180-200bp及其整數倍的片段。染色體DNA斷裂而產生大量的粘性3'-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標記到DNA的3'-末端，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法（TUNEL）。由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3'-OH形成，很少能夠被染色。
細胞TUNEL染色
04
細胞活性檢測
1. CCK-8/MTT檢測
2. 乳酸脫氫酶(LDH)釋放法檢測NK細胞活性
乳酸脫氫酶(LDH)是活細胞胞漿內含酶之一。在正常情況下，不能透過細胞膜。當靶細胞受到效應細胞的攻擊而損傷時，細胞膜通透性改變，LDH可釋放至介質中，釋放出來的LDH在催化乳酸生成丙酮酸的過程中，使氧化型輔酶I(NAD+)變成還原型輔酶I (NADH2），后者再通過遞氫體-吩嗪二甲酯硫酸鹽(PMS)還原碘硝基氯化氮唑藍(INT)或硝基氯化四氮唑藍(NBT)形成有色的甲簪類化合物，在490nm或570nm波長處有一高吸收峰，利用讀取的OD值，經過計算即可得NK細胞活性。1．靶細胞制備
取培養24～48h的靶細胞，洗滌3次，最后用完全RPMI-1640培養液調整細胞濃度至1×105／ml，備用。2．效應細胞的制備
常規方法分離PBMC或小鼠脾細胞，洗滌3次，最后用完全RPMI-1640培養液調整細胞濃度至1×107／ml。3．效-靶細胞作用
將效應細胞和靶細胞各0.1ml(E/T＝100∶1)加入40孔細胞培養板的孔中，每份標本設3復孔，同時設靶細胞自然釋放對照組和最大釋放對照組(0.1ml靶細胞＋0.1ml 1％NP-40液)，低速離心1000r／min，2min后，置37℃、5％CO2溫箱中孵育2h。4．酶促反應
取出培養物，吸取各孔上清0.1ml加于另一培養板孔中，置37℃預溫10min，每孔加入新鮮配制的LDH底物溶液0.1ml，室溫避光反應10～15min，每孔加入1mol/L檸檬酸終止液30μl，以終止酶促反應。5．結果計算
用酶聯檢測儀在570nm波長下讀取各孔OD值，并計算NK細胞活性。
LDH 釋放實驗檢測細胞毒性
05
總結
近幾年細胞焦亡的持續火爆，細胞焦亡國自然中標項目數量逐年增加，尤其近兩年呈直線上升趨勢。PubMed中大于5分的相關研究文章超過2000篇；同時，從近幾年命中的國自然項目中，我們也可以發現，在多種疾病或研究領域均有細胞焦亡的相關研究即將受到國自然基金委的資助。
主營項目
1. 動物實驗
動物飼養、疾病造模、行為學檢測、心功能、無創血壓、血常規、全自動生化檢測等
2. 細胞實驗
CCK8/MTT、原代細胞分離、流式細胞實驗、細胞劃痕、侵襲、遷移、EDU染色、轉染、穩定株
3. 分子生物學
PCR檢測、熒光定量PCR、絕對定量PCR、端粒酶長度、pull down、雙熒光素酶、SSR、SNP檢測等
4. 蛋白實驗
WB、Co-IP、酵母雙雜
5. 病理實驗
HE染色、免疫組學、電鏡
6. 生理生化實驗
肝腎功能、抗氧化、免疫反應等生理免疫指標;動植物營養指標、微量元素、重金屬、酶活等。
7. 多組學實驗
基因組、轉錄調控、蛋白組、代謝組、微生物多樣性、宏基因組、生信分析
8. 整體課題實驗
方案設計、整體實驗交付、標書寫作、論文潤色、協助投稿
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康旭禾生物提供包括動物實驗、細胞實驗、分子實驗、病理實驗、流式檢測實驗及論文翻譯、潤色、投稿輔助等相關的各項服務。
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