腫瘤研究基礎---Transwell遷移/侵襲實驗
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發表時間：2025-08-29
對腫瘤的研究，主要包括功能研究和機制研究，細胞功能的研究主要是體現腫瘤生物學特性。其中腫瘤細胞的遷移、侵襲功能研究是必不可少的，腫瘤細胞的遷移侵襲能力的研究，也為后續信號通路、功能機制研究打下基礎。 Transwell 遷移、侵襲實驗主要用于檢測腫瘤細胞體外的遷移、侵襲能力，由此可見，做好Transwell遷移侵襲實驗是至關重要的。
1.實驗原理
將Transwell小室放入培養板中，小室內稱上室，培養板內稱下室，上室內盛裝上層培養液，下室內盛裝下層培養液，上下層培養液以聚碳酸酯膜相隔。我們將細胞種在上室內，由于聚碳酸酯膜有通透性，下層培養液中的成分可以影響到上室內的細胞，從而可以研究下層培養液中的成分對細胞生長、運動等的影響。
應用不同孔徑和經過不同處理的聚碳酸酯膜，就可以進行共培養、細胞趨化、細胞遷移、細胞侵襲等多種方面的研究。侵襲實驗中使用到的Matrigel 是從小鼠EHS肉瘤中提取的基質成分，含有LN、IV型膠原、接觸蛋白和肝素硫酸多糖，鋪在無聚乙烯吡硌烷酮的聚碳酸酯濾膜上，能在DMEM培養基中重建形成膜結構，這種膜結構與天然基質膜結構極為相似。
Transwell小室的濾膜孔徑一般為8μm，在侵襲實驗中，膜孔都被Matrigel覆蓋，細胞不能自由穿過，必須分泌水解酶，并通過變形運動才能穿過這種鋪有Martrigel 的濾膜，這與體內情況較為相似。細胞欲進入下室，先要分泌基質金屬蛋白酶（MMPs）將基質膠降解，方可通過聚碳酸酯膜。計數進入下室的細胞量可反映腫瘤細胞的侵襲能力。
2. 材料與試劑
?Transwell小室
?細胞生長培養基
?胎牛血清
?胰蛋白酶
?PBS?青霉素-鏈霉素溶液（100×）
?結晶紫或臺盼藍
?4%多聚甲醛?Matrigel（侵襲實驗）
3. 實驗步驟
1、實驗前一天，將已經分裝后的一管Matrigel基質膠從-20℃提前放入4℃冰箱過夜，Matrigel膠即從固體狀態融化為液體狀態。Matrigel基質膠以1：8稀釋后包被transwell小室底部膜的上室面(整個過程注意冰上操作，否則Matrigel在10℃以上即會凝固)，3小時風干。注：如進行遷移實驗，則跳過這一步驟。
2、水化基底膜：吸出培養板中殘余液體，每孔加入50μL 10g/LBSA的無血清培養液，37 ℃，30min。
3、常規胰酶消化細胞，PBS洗1-2遍去除血清的影響，用無血清培養基重懸細胞，調整細胞密度為5*105個/mL。
4、取200μL細胞懸液加入Transwell小室上室， 24孔培養板下室內加入600μL 含10% FBS培養基。注意下層培養液與小室之間不要產生氣泡。
5、培養板置于37℃的CO2培養箱中，依據腫瘤細胞侵襲能力而定培養12-48h。
6、取出小室，PBS淋洗2遍，用棉簽小心擦去小室微孔膜上層內的細胞，在24孔板內4%多聚甲醛(或95%酒精)固定20 min，結晶紫溶液染色15 min。
7、倒置顯微鏡下拍照，每個樣本隨機計數10個視野，取平均值，統計分析。
4. 實驗結果
拍照結果呈現
5.注意事項
1、細胞接種劑量不同的細胞，其侵襲能力是不同的，細胞量過多，穿過膜的細胞會過多過快，最后會難以統計結果;而細胞量過少，可能還沒到檢測的時間點，所有的細胞都已穿過，進入下室。因此最少也要保證在收樣的時候，上室內還要有一定量的細胞存在。
幾種常見細胞的每孔接種數量如下表：(個人經驗，不同實驗室可能略有差異)
2、避免產生氣泡下層培養液和小室間常會有氣泡產生，一旦產生氣泡，下層培養液的趨化作用就減弱甚至消失了，將小室放入培養板時要注意，如有氣泡產生，須將小室提起，去除氣泡，再將小室放進培養板。 3、檢測時間點培養時間主要依癌細胞侵襲能力而定，時間點的選擇除了要考慮到細胞、細胞侵襲力及處理因素等。 4、注意事項用棉簽擦掉上室細胞時注意不要蹭到已穿膜的那一層細胞。 5、對于比較難穿膜的細胞，可以在實驗開展前撤掉血清，饑餓處理12h-24h。
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